【摘要】：背景:腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展存在復(fù)雜調(diào)控機制,如何攻克膠質(zhì)瘤始終是研究熱點及難點。目前膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者平均中位生存期只有12～18月,既往研究NF2基因與腫瘤發(fā)病過程關(guān)系密切,是一個重要腫瘤抑制因子,NF2基因表達產(chǎn)物merlin蛋白在腫瘤細(xì)胞調(diào)控過程作用關(guān)鍵。DNMT對NF2基因甲基化進行催化,異常DNMT表達與腫瘤發(fā)生緊密聯(lián)系,而大量破壞DNA甲基化正是膠質(zhì)瘤細(xì)胞迅速增殖的特性。已有大量研究發(fā)現(xiàn)不同miRNAs因子失調(diào)與腫瘤發(fā)病機制之間密切相關(guān),但miRNAs和DNMT1之間調(diào)控機制及與膠質(zhì)瘤凋亡、侵襲關(guān)系仍有待研究。目的和意義:本課題圍繞miR-152-3p與DNMT1-NF2通路之間的調(diào)控機制,研究這條通路對膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展及凋亡等生物學(xué)行為的影響。通過檢測miR-152-3p、DNMT1、NF2及其甲基化在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達,分析miR-152-3p、DNMT1、NF2三者與膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡、侵襲細(xì)胞學(xué)之間關(guān)系的實驗,探討miR-152-3p、DNMT1、NF2與膠質(zhì)瘤發(fā)病機制之間關(guān)系,尋找調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及侵襲新的環(huán)路。方法:本課題研究分兩部分內(nèi)容:第一章qRT-PCR和Western blot檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-152-3p、DNMT1、NF2表達;免疫組化檢測正常人腦組織和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中DNMT1、merlin蛋白表達;MSP和BSP檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中NF2基因甲基化程度。第二章DNMT1基因siRNA重組質(zhì)粒與NF2過表達載體構(gòu)建;將敲減DNMT1基因表達質(zhì)粒及NF2、miR-152-3p過表達載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞;qRT-PCR、Westm blot、MSP和BSP檢測轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-152-3p、DNMT1、NF2表達;CCK方法檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖情況;免疫熒光實驗對CCK結(jié)果進行驗證;流式細(xì)胞學(xué)方法、EDU方法檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡情況;評估transwell侵襲實驗轉(zhuǎn)染后U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞情況;雙熒光素酶實驗對miR-152-3p的靶點進行驗證。結(jié)果:NF2甲基化引起DNMT1在膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤組織和U251、U87、T98-G、A172膠質(zhì)瘤細(xì)胞系表達明顯增加。敲低DNMT1mRNA表達引起NF2去甲基化,提高NF2轉(zhuǎn)錄及翻譯水平表達。實驗發(fā)現(xiàn)miR-152-3p在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織表達明顯減少,miR-152-3p直接靶向調(diào)節(jié)DNMT1,兩者潛在結(jié)合位點是DNMT13'-UTR的48～55位置。而且我們發(fā)現(xiàn)miR-152-3p、NF2過表達和敲低DNMT1顯著誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞侵襲活力。MiR-152-3p通過減少DNMT1表達抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲活性。結(jié)論:1.膠質(zhì)瘤發(fā)病過程DNMT1和miR-152-3p組成一個負(fù)反饋環(huán),NF2和miR-152-3p形成一個正反饋環(huán),miRNA在調(diào)控通路起腫瘤抑制因子作用。2.MiR-152-3p通過減少DNMT1表達抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲活性。3.MiR-152-3p作為一個新型提升膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的調(diào)節(jié)因子和希望為膠質(zhì)瘤治療提供一個新的治療途徑。
【圖文】：

逡逑瘤是否存在聯(lián)系。圖１－１Ｃ中ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測這２０對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及正常腦組織逡逑標(biāo)本中ｍｉＲ－１５２－３ｐ的表達，，正常腦組織標(biāo)本ｍｉＲ－１５２－３ｐ的表達明顯高于膠質(zhì)逡逑母細(xì)胞瘤標(biāo)本表達，我們推測ｍｉＲ－１５２－３ｐ可能對膠質(zhì)瘤生長起抑制作用。逡逑表邋１－１：邋ｍｉＲ－１５２－３ｐ、ＤＮＭＴ１、ＮＦ２ｍＲＮＡ邋在腦和邋ＧＢＭ邋組織表達（又土Ｓ）逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－１邋：邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＮＦ２，邋ＤＮＭＴ１邋ａｎｄ邋ｍｉＲ－１５２－３ｐ邋ｉｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｂｒａｉｎ邋ａｎｄ邋ＧＢＭ邋ｔｉｓｓｕｅｓ逡逑（Ｘ±Ｓ）逡逑基因表達邐平均值邐ＳＤ值邐Ｐ逡逑腦組織組ＮＦ２邐０．９３邐０．２３逡逑＜０．０１逡逑ＧＢＭ邋組邋ＮＦ２邐０．４０邐０．１５逡逑腦組織組邋ＤＮＭＴ１邐１．０８邐０．３４逡逑＜０．０１逡逑ＧＢＭ邋組邋ＤＮＭＴ１邐３．７６邐１．２６逡逑腦組織組邋ｍｉＲ－１５２－３ｐ邐１．０５邐０．１８逡逑＜０．０１逡逑ＧＢＭ邋組邋ｍｉＲ－１５２－３ｐ邐０．４１邐０．１４逡逑Ａ邋２（Ｈ邐ＮＦ２邐？邋８邐ＤＮＭＴ１邐＾邐ｍｉＲ－１５２－３ｐ逡逑ｇ邋１邐＇￣＾￣￣邐｜邐＊￣＾￣；邐｜邐唯逡逑ｒ邋ｔ邋ｎ邋ｉ邋＾逡逑０．０－＊邐１邐Ｊ邐邋邐１邐ｊ邐邋0．0ｔ邐？邐逡逑Ｎ邐Ｇ邐Ｎ邐Ｇ邐Ｎ邐Ｇ逡逑圖１－ｈ邋Ｎ為正常腦組織，Ｇ為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織。ｑＲＴ－ＰＣＲ檢測正常腦組織和膠質(zhì)母細(xì)逡逑胞瘤組織ｈａｓ－ｍｉＲ－１５２－３ｐ邋（Ａ）、ＤＮＭＴ１邋（Ｂ）、ＮＦ２邋（Ｃ）的ｒｎＲＮＡ表達

圖１－２Ｂ：免疫印跡檢測在ＨＥＢ邋（正常）、Ｕ２５１、Ｕ８７、Ｔ９８－Ｇ、Ａ１７２膠質(zhì)瘤細(xì)胞中ＤＮＭＴｌ逡逑蛋白和Ｍｅｒｌｉｎ蛋白水平。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋ｌ－２Ｂ：Ｔｈｅ邋ｃｅｌｌｓ邋ｏｆ邋ＨＥＢ，邋Ｕ２５１，邋Ｕ８７，邋ＴＧ－Ｇ邋ａｎｄ邋Ａ１７２邋ｗｅｒｅ邋ｕｓｅｄ邋ｔｏ邋ｄｅｔｅｃｔ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑３０逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R739.41

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本文編號：2610660