發(fā)布時(shí)間：2020-03-28 14:15

【摘要】：膠質(zhì)瘤是最為常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤,約占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的27%,約占顱內(nèi)惡性腫瘤的80%,是人類最難治性腫瘤之一~([1])。盡管近年來(lái),手術(shù)結(jié)合同步放化療的治療策略使患者預(yù)后有所改善,但最新的美國(guó)腦腫瘤注冊(cè)中心(central brain tumor registry of the united states,CBTRUS)顯示膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的五年生存率仍僅為5.5%,腫瘤內(nèi)部復(fù)雜的不均一性是導(dǎo)致其對(duì)各種理化因素的抵抗并進(jìn)展復(fù)發(fā)的關(guān)鍵~([2])。膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(glioma initiating cells,GICs)是一群具有自我更新、無(wú)限增殖、多向分化潛能的腫瘤細(xì)胞,他們常常分布于腫瘤壞死區(qū)、微血管周?chē)约澳[瘤組織邊緣,被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展和復(fù)發(fā)的“主角”~([3])。因此,膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的自我更新、侵襲遷移等生物學(xué)行為及其在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用成為了目前的研究熱點(diǎn)。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),Notch1信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells,GSCs)中高度激活,Notch1信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)在調(diào)控膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖、干性維持、分化等行為中發(fā)揮著重要作用~([4]),不同于傳統(tǒng)的依靠游離性配體與細(xì)胞表面受體結(jié)合的方式激活細(xì)胞信號(hào)通路,Notch通路的配體與受體均為細(xì)胞表面跨膜蛋白,只有通過(guò)受體配體細(xì)胞相互接觸,才能實(shí)現(xiàn)配體與受體的結(jié)合而啟動(dòng)Notch信號(hào)~([5])。當(dāng)Notch通路激活后,γ-分泌酶將發(fā)揮水解作用,使Notch胞內(nèi)域(Notch intracellular domain,NICD)被切割并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子CBF1結(jié)合,活化下游包括Hes和Hey家族靶基因表達(dá),從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為~([6])。在非小細(xì)胞型肺癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤中均已發(fā)現(xiàn)Notch通路可以通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表型的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),增強(qiáng)其遷移和侵襲能力~([8-10])。在人腦腫瘤中,Notch通路呈異常激活,并且主要富集于腫瘤干細(xì)胞中,并調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)行為~([7])。然而,對(duì)于Notch信號(hào)通路調(diào)控膠質(zhì)瘤干細(xì)胞生物學(xué)行為的具體機(jī)制目前尚未研究清楚。趨化因子受體4(C-X-C chemokine receptor type 4,CXCR4)因被用來(lái)提取純化艾滋病毒的幾個(gè)趨化因子受體而被認(rèn)識(shí),近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),CXCR4在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá),在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CXCR4也有表達(dá)并與腫瘤級(jí)別相關(guān),隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增高,CXCR4的表達(dá)水平也相應(yīng)升高,并與患者的生存預(yù)后相關(guān)~([11])。有研究指出相對(duì)于低表達(dá)CXCR4的膠質(zhì)瘤病人,高表達(dá)CXCR4的膠質(zhì)瘤病人在放化療后有更高的復(fù)發(fā)幾率,預(yù)后更差~([12])。CXCR4可以與其特異性的配體基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(Stromal cell-derived factor 1,SDF-1)又稱為趨化因子受體(C-X-C motif chemokine 12,CXCL12)結(jié)合,他們?cè)趷盒阅z質(zhì)瘤細(xì)胞的趨化遷移及血管生成中發(fā)揮著極為重要的作用。相對(duì)于普通培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞,CXCR4被發(fā)現(xiàn)在GSCs中高度激活,一方面CXCR4可以促進(jìn)侵襲性偽足形成及基質(zhì)金屬蛋白的分泌來(lái)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲遷移,另一方面CXCR4也可通過(guò)PI3k/AKT、ERK等信號(hào)通路調(diào)控編碼膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖、干性維持及侵襲遷移等基因的轉(zhuǎn)錄。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞還可以通過(guò)自分泌或旁分泌CXCL12來(lái)維持自身干性及增殖狀態(tài)~([13])。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)Notch1信號(hào)通路分子與CXCR4在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本中具有共表達(dá)趨勢(shì),它們?cè)诘鞍姿降谋磉_(dá)均隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的增高而增高,而針對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(包括膠質(zhì)瘤傳統(tǒng)細(xì)胞系、膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞系)mRNA表達(dá)譜也發(fā)現(xiàn),相對(duì)于膠質(zhì)瘤傳統(tǒng)細(xì)胞系,Notch1和CXCR4均在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中富集,提示在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中Notch1和CXCR4可能存在著Crosstalk共同調(diào)控著膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生物學(xué)行為。本課題主要研究Notch1信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞自我更新和侵襲運(yùn)動(dòng)中的作用及其潛在的調(diào)節(jié)機(jī)制,研究分為以下四個(gè)部分:1.Notch1信號(hào)通路分子在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及與預(yù)后關(guān)系�；虮磉_(dá)譜交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)在線基因分析Notch1在不同系統(tǒng)腫瘤與對(duì)照組織中的mRNA表達(dá)比,我們發(fā)現(xiàn)相對(duì)于其他系統(tǒng)腫瘤,Notch1在GBM中顯著高表達(dá);生物信息學(xué)提取從Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)Bredel Brain 2和Sun Brain mRNA數(shù)據(jù)分析并再次驗(yàn)證Notch1在對(duì)照腦組織及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)差異;生物信息學(xué)提取膠質(zhì)瘤TCGA mRNA及臨床資料數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)Hes1表達(dá)與膠質(zhì)瘤病人預(yù)后相關(guān);GEO數(shù)據(jù)庫(kù)采集Notch1和CXCR4在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞系及傳統(tǒng)細(xì)胞系中的mRNA表達(dá)譜,結(jié)果顯示Notch1和CXCR4在均在GICs中富集,并具有共表達(dá)趨勢(shì)。2.Notch1對(duì)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞侵襲遷移、自我更新能力的影響。我們利用慢病毒轉(zhuǎn)染,建立了Notch1蛋白穩(wěn)定低表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。用干細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)的方法獲得膠質(zhì)瘤細(xì)胞球,并利用免疫磁珠分進(jìn)一步選出CD133~+的膠質(zhì)瘤細(xì)胞。通過(guò)Transwell侵襲遷移試驗(yàn)、熒光基質(zhì)膠降解試驗(yàn)證實(shí)Notch1對(duì)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞侵襲遷移能力的促進(jìn)作用。通過(guò)細(xì)胞球形成試驗(yàn)、體外極限稀釋試驗(yàn)證實(shí)了Notch1對(duì)于膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞自我更新能力具有維持作用。3.Notch1通過(guò)CXCR4介導(dǎo)調(diào)控AKT/mToR通路影響膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞侵襲遷移、自我更新能力。通過(guò)Western blot發(fā)現(xiàn)敲低Notch1可以下調(diào)Hes1、CXCR4、pAKT、pmTOR的蛋白水平的表達(dá),證明了CXCR4和AKT是Notch1通路的下游。隨后添加CXCL12與對(duì)照組相比Notch1、Hes1蛋白無(wú)明顯變化,而p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯增加,提示在膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞中,CXCL12/CXCR4趨化因子系統(tǒng)是Notch1信號(hào)通路的下游,它的激活可以提高下游AKT/mTOR信號(hào)通路的活性。4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Notch1通過(guò)CXCR4調(diào)控膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞侵襲遷移能力。將不同處理組(shNC組、sh1組和sh2組)的膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞分別進(jìn)行裸鼠鼠腦原位種植,觀察并記錄荷瘤鼠飼養(yǎng)過(guò)程中的體重、生存期等指標(biāo)。利用小動(dòng)物活體成像儀通過(guò)荷瘤鼠腫瘤細(xì)胞生物發(fā)光的信號(hào)強(qiáng)弱來(lái)觀察腫瘤生長(zhǎng)大小。免疫組織化學(xué)染色觀察不同處理組組織標(biāo)本中Notch1、CXCR4、pAKT等蛋白表達(dá)變化。HE(蘇木素伊紅)染色觀察腫瘤組織與正常腦組織交界處邊緣形態(tài)。統(tǒng)計(jì)不同處理組小鼠體重、生存時(shí)間變化是否具有差異。結(jié)果顯示:敲低Notch1可以顯著地減緩腫瘤生長(zhǎng)速度,改善小鼠預(yù)后,在體內(nèi)微環(huán)境中,Notch1-CXCR4-AKT軸性通路仍然存在。結(jié)論:1.Notch1信號(hào)通路在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高度激活,Notch1在膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞中高表達(dá)。2.Notch1可以調(diào)控膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的侵襲遷移及自我更新能力。3.Notch1通過(guò)CXCR4介導(dǎo)作用于AKT/mTOR通路調(diào)控膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的侵襲遷移及自我更新能力。4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Notch1通過(guò)CXCR4介導(dǎo)促進(jìn)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲遷移能力。
【圖文】：

胞癌；KIRC 腎透明細(xì)胞癌；KIRP:腎乳頭狀細(xì)胞癌；L肝細(xì)胞癌；LUAD:肺腺癌；LUSC:肺鱗癌；OV:卵巢漿液:前列腺癌；READ:直腸腺癌；SARC:肉瘤；SKCM：皮膚睪丸生殖細(xì)胞腫瘤；THCA:甲狀腺癌；THYM:胸腺癌；肉瘤；）與膠質(zhì)瘤病人預(yù)后關(guān)系劃圖譜（TheCancerGenomeAtlas,TCGA） 702 例-Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤病人和 172 例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人）獲 Hes1 的 mRNA 表達(dá)值及相應(yīng)病人總生存期s1 表達(dá)值中位數(shù)為分割點(diǎn)，繪制 KaplanMeier 生析差異標(biāo)注 P 值。結(jié)果顯示，，與 Hes1 表達(dá)高的病的病人（藍(lán)線）具有更高的存活率（P<0.001）,這差。

天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 一、Notch1 信號(hào)通路分子在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況及其與預(yù)后關(guān)1.2.3 Notch1 信號(hào)通路在膠質(zhì)瘤普通細(xì)胞系及膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞系中的表達(dá)從 GEO：GSE23806 獲取 36 例膠質(zhì)瘤普通細(xì)胞系及 44 例膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的 mRNA 數(shù)據(jù)，運(yùn)用 Morpheus 在線工具進(jìn)行 mRNA 差異基因聚類分析，從中我們可以看出，Notch1 信號(hào)通路中的分子包括 Notch1、Hes1 和 CXCR4 等號(hào)通路分子主要在在膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞系富集而在非膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞系中表達(dá)低。并列舉了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物如 CD133(PROM1)和 Nestin(NES)在膠質(zhì)起始細(xì)胞和非膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞中的表達(dá)分布予以驗(yàn)證。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R739.41

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10 彭功玲;田野;逯

本文編號(hào)：2604563