發(fā)布時(shí)間：2020-03-28 03:32

【摘要】：蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)主要由顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂引起,約占急性腦卒中的10%,有著很高的致死率和致殘率。近年來,SAH后的自噬現(xiàn)象及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系日益受到廣泛關(guān)注。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上探討了具有神經(jīng)保護(hù)作用的骨橋蛋白(osteopontin,OPN)對(duì)SAH后自噬現(xiàn)象及自噬-凋亡關(guān)系的影響及其可能的作用機(jī)制。本研究建立了 SD大鼠血管內(nèi)穿刺SAH模型,所使用的行為學(xué)試驗(yàn)包括Garcia神經(jīng)功能評(píng)分、大鼠平衡木試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)平衡木試驗(yàn)(Rotarod)及Morris水迷宮試驗(yàn)。使用的生理生化及組織學(xué)實(shí)驗(yàn)方法包括Western Blot,免疫熒光雙標(biāo)染色,自噬-凋亡蛋白的熒光雙標(biāo)染色,Fluoro-jade C退行性神經(jīng)元染色、尼氏染色和原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)。本研究首先探討了 SAH后內(nèi)源性O(shè)PN及自噬相關(guān)蛋白(Beclin1,ATG5和LC-3 Ⅱ/Ⅰ)表達(dá)隨時(shí)間的變化及在腦內(nèi)各種細(xì)胞類型中的分布。研究發(fā)現(xiàn)SAH后內(nèi)源性O(shè)PN與三種自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平均隨時(shí)間遞增,并于SAH后24h達(dá)到峰值。此外,內(nèi)源性O(shè)PN與自噬啟動(dòng)蛋白Beclin1在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá),但均主要表達(dá)于神經(jīng)元內(nèi)。繼而本研究將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、重組骨橋蛋白治療組(SAH+rOPN,每只大鼠于術(shù)后1h經(jīng)鼻腔給予5μg大鼠源性重組骨橋蛋白)和安慰劑治療組(SAH+Vehicle,每只大鼠于術(shù)后1h經(jīng)鼻腔給予等量的PBS),研究了 SAH后經(jīng)鼻腔給予重組骨橋蛋白(recombinantosteopontin,rOPN)對(duì)神經(jīng)元自噬、凋亡水平以及自噬-凋亡關(guān)系的影響,并同時(shí)關(guān)注了 SAH后經(jīng)鼻腔給予rOPN對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的短期(術(shù)后24h)及長(zhǎng)期(術(shù)后一至三周)神經(jīng)功能的影響。研究結(jié)果提示SAH后經(jīng)鼻腔給予rOPN能顯著減少術(shù)后24h大鼠損傷半腦內(nèi)的Fluoro-jade C陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)、降低促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3和Bax的表達(dá)量、同時(shí)顯著上調(diào)自噬相關(guān)蛋白(Beclin1,ATG5和LC-3 Ⅱ/Ⅰ)的表達(dá)(P0.05),并在細(xì)胞層面上影響自噬-凋亡之間的相互作用。與此同時(shí),SAH后經(jīng)鼻腔早期給予rOPN可顯著改善實(shí)驗(yàn)大鼠短期和長(zhǎng)期的運(yùn)動(dòng)平衡能力及長(zhǎng)期記憶功能,減輕遠(yuǎn)期海馬損傷(P0.05)。此遠(yuǎn)期效果可能源于早期rOPN給藥對(duì)于早期腦損傷(early brain injury,EBI)的減輕。此后進(jìn)一步的機(jī)制研究中增設(shè)FAK磷酸化抑制劑組(SAH+rOPN+Fib-14,每只大鼠于造模前1h經(jīng)腹腔注射30mg/kg的FAK抑制劑-14)及其溶劑對(duì)照組(SAH+rOPN+DMSO,每只大鼠于造模前1h經(jīng)腹腔注射等量的DMSO)對(duì)FAK通路進(jìn)行干預(yù),并發(fā)現(xiàn)阻斷FAK蛋白磷酸化可使其下游信號(hào)分子ERK1/2的磷酸化水平顯著增加,從而部分逆轉(zhuǎn)rOPN治療帶來的短期神經(jīng)功能改善及自噬水平增加(P0.05),提示FAK-ERK信號(hào)通路可能參與OPN誘導(dǎo)的自噬增強(qiáng)現(xiàn)象的上游調(diào)控。綜上所述,SAH后予rOPN治療可通過激活自噬和調(diào)節(jié)自噬-凋亡相互作用來抑制神經(jīng)元凋亡,減輕EBI。此外提示,SAH后早期給予rOPN可能為預(yù)防和治療遲發(fā)性腦損傷的有效策略。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R743.35

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