發(fā)布時間：2020-03-28 03:32

【摘要】：蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)主要由顱內動脈瘤破裂引起,約占急性腦卒中的10%,有著很高的致死率和致殘率。近年來,SAH后的自噬現(xiàn)象及其與細胞凋亡的關系日益受到廣泛關注。本研究在前期研究的基礎上探討了具有神經保護作用的骨橋蛋白(osteopontin,OPN)對SAH后自噬現(xiàn)象及自噬-凋亡關系的影響及其可能的作用機制。本研究建立了 SD大鼠血管內穿刺SAH模型,所使用的行為學試驗包括Garcia神經功能評分、大鼠平衡木試驗、旋轉平衡木試驗(Rotarod)及Morris水迷宮試驗。使用的生理生化及組織學實驗方法包括Western Blot,免疫熒光雙標染色,自噬-凋亡蛋白的熒光雙標染色,Fluoro-jade C退行性神經元染色、尼氏染色和原位末端轉移酶標記技術(TUNEL)。本研究首先探討了 SAH后內源性OPN及自噬相關蛋白(Beclin1,ATG5和LC-3 Ⅱ/Ⅰ)表達隨時間的變化及在腦內各種細胞類型中的分布。研究發(fā)現(xiàn)SAH后內源性OPN與三種自噬相關蛋白的表達水平均隨時間遞增,并于SAH后24h達到峰值。此外,內源性OPN與自噬啟動蛋白Beclin1在神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞均有表達,但均主要表達于神經元內。繼而本研究將實驗大鼠隨機分為假手術組(Sham)、重組骨橋蛋白治療組(SAH+rOPN,每只大鼠于術后1h經鼻腔給予5μg大鼠源性重組骨橋蛋白)和安慰劑治療組(SAH+Vehicle,每只大鼠于術后1h經鼻腔給予等量的PBS),研究了 SAH后經鼻腔給予重組骨橋蛋白(recombinantosteopontin,rOPN)對神經元自噬、凋亡水平以及自噬-凋亡關系的影響,并同時關注了 SAH后經鼻腔給予rOPN對實驗大鼠的短期(術后24h)及長期(術后一至三周)神經功能的影響。研究結果提示SAH后經鼻腔給予rOPN能顯著減少術后24h大鼠損傷半腦內的Fluoro-jade C陽性染色細胞數(shù)、降低促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3和Bax的表達量、同時顯著上調自噬相關蛋白(Beclin1,ATG5和LC-3 Ⅱ/Ⅰ)的表達(P0.05),并在細胞層面上影響自噬-凋亡之間的相互作用。與此同時,SAH后經鼻腔早期給予rOPN可顯著改善實驗大鼠短期和長期的運動平衡能力及長期記憶功能,減輕遠期海馬損傷(P0.05)。此遠期效果可能源于早期rOPN給藥對于早期腦損傷(early brain injury,EBI)的減輕。此后進一步的機制研究中增設FAK磷酸化抑制劑組(SAH+rOPN+Fib-14,每只大鼠于造模前1h經腹腔注射30mg/kg的FAK抑制劑-14)及其溶劑對照組(SAH+rOPN+DMSO,每只大鼠于造模前1h經腹腔注射等量的DMSO)對FAK通路進行干預,并發(fā)現(xiàn)阻斷FAK蛋白磷酸化可使其下游信號分子ERK1/2的磷酸化水平顯著增加,從而部分逆轉rOPN治療帶來的短期神經功能改善及自噬水平增加(P0.05),提示FAK-ERK信號通路可能參與OPN誘導的自噬增強現(xiàn)象的上游調控。綜上所述,SAH后予rOPN治療可通過激活自噬和調節(jié)自噬-凋亡相互作用來抑制神經元凋亡,減輕EBI。此外提示,SAH后早期給予rOPN可能為預防和治療遲發(fā)性腦損傷的有效策略。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R743.35

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