【摘要】：研究目的:隨著全球人口老齡化的迅速加劇,由增齡誘發(fā)的多種代謝性疾病越發(fā)受到關(guān)注。增齡性骨骼肌萎縮(指與年齡相關(guān)的漸進(jìn)性骨骼肌丟失與功能下降)對(duì)老年人健康產(chǎn)生多種負(fù)面影響,而規(guī)律運(yùn)動(dòng)則可顯著延緩老年人骨骼肌萎縮,但其機(jī)制尚不明確。增齡性骨骼肌萎縮與骨骼肌細(xì)胞衰老密切相關(guān),有學(xué)者認(rèn)為異常線粒體在骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的堆積是促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞衰老的重要因素。在衰老過程中堆積的異常線粒體DNA、受損的線粒體蛋白、氧化呼吸鏈過度產(chǎn)生的活性氧(ROS)都可加速骨骼肌細(xì)胞衰老。此外,有研究發(fā)現(xiàn)在衰老骨骼肌細(xì)胞線粒體融合、分裂比例失衡,線粒體融合相對(duì)增多導(dǎo)致巨大線粒體的產(chǎn)生,并且由于線粒體自噬水平下降,受損線粒體無法及時(shí)清除,致使受損巨大線粒體對(duì)骨骼肌細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重破壞,這可能是增齡性骨骼肌萎縮的關(guān)鍵誘因之一。Sestrins是一類具有抗衰老作用的應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白,可通過其自身抗氧化作用清除細(xì)胞內(nèi)多余的氧化自由基,并且調(diào)控細(xì)胞內(nèi)AMPK,mTOR等能量感受信號(hào)蛋白,調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝。此外,研究發(fā)現(xiàn)Sestrins與細(xì)胞自噬活動(dòng)密切相關(guān),而在衰老骨骼肌細(xì)胞由于受損線粒體大量堆積,因此Sestrins的抗氧化及促自噬功能可能在保護(hù)衰老骨骼肌受損線粒體中發(fā)揮重要作用,其具體調(diào)控機(jī)制亟需深入研究。本課題將重點(diǎn)探討Sestrins與衰老骨骼肌中線粒體的相互作用關(guān)系,以期為揭示Sestrins在運(yùn)動(dòng)改善增齡性骨骼肌萎縮的機(jī)制提供理論依據(jù)。研究方法:(1)動(dòng)物模型:3月齡C57BL/6青年雄性小鼠(YS)8只,12月齡C57BL/6老年雄性小鼠16只,隨機(jī)分為老年安靜對(duì)照組(OS)、老年運(yùn)動(dòng)組(OE)。此外,選用3月齡雄性野生型以及AMPKα2基因敲除鼠各8只,隨機(jī)分為安靜組和運(yùn)動(dòng)組。運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束后行肌力測(cè)試、體成分分析、稱量體重,隨后處死取材;(2)運(yùn)動(dòng)方案:老年運(yùn)動(dòng)組干預(yù)時(shí)間為8個(gè)月,AMPKα2基因敲除鼠運(yùn)動(dòng)組干預(yù)時(shí)間為6周,運(yùn)動(dòng)形式為75%VO_2max強(qiáng)度的有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng),坡度為0,60分/次,1次/天,5次/周;(3)體成分檢測(cè):運(yùn)動(dòng)干預(yù)結(jié)束后使用“ImpediVET實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體組成測(cè)定分析儀”輸出體質(zhì)指數(shù),去脂體重,體脂含量等指標(biāo),隨后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;(4)電鏡觀察:在小鼠處死后,迅速分離腓腸肌,經(jīng)2.5%戊二醛和1%鋨酸固定、酒精和丙酮梯度脫水、環(huán)氧樹脂包埋、制備超薄切片,并在30000倍視野下觀察線粒體形態(tài);(5)細(xì)胞培養(yǎng):C2C12肌原細(xì)胞經(jīng)含2%馬血清的1×DMEM誘導(dǎo)分化為肌管細(xì)胞,應(yīng)用Sesn1-siRNA、Sesn2-siRNA干預(yù)細(xì)胞,采用活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)干預(yù)后細(xì)胞ROS水平,后提取細(xì)胞蛋白;(6)取小鼠腓腸肌,經(jīng)4%中性甲醛固定、酒精梯度脫水、石蠟包埋、制備5μm切片,而后組織進(jìn)行HE染色,光鏡下觀察各組小鼠腓腸肌橫截面積;(7)Western blot法檢測(cè)骨骼肌組織或C2C12細(xì)胞Sesn1,Sesn2,Sesn3,pAMPK-Thr172,Drp1,Mfn2,Pink1,p62,PGC-1α,COX4,IL6及TNF-α蛋白表達(dá)水平。研究結(jié)果:(1)長期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠增齡過程中體重增加無顯著影響,但可增加老年小鼠腓腸肌與體重比、去脂體重、抓力、抓力與體重比、腓腸肌肌纖維橫截面積,降低脂肪含量,減少衰老骨骼肌中炎癥因子(TNF-α)的產(chǎn)生;(2)長期有氧運(yùn)動(dòng)可有效減少衰老骨骼肌中巨大線粒體的產(chǎn)生,同時(shí)增加線粒體功能相關(guān)蛋白Drp1,Mfn2,PGC-1α及COX4,以及線粒體自噬蛋白Pink1的表達(dá),降低P62表達(dá);(3)老年小鼠骨骼肌中Sesn1和Sesn2的表達(dá)量下降而Sesn3表達(dá)無顯著變化,其中抑制Sesn1表達(dá)對(duì)線粒體調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白表達(dá)無顯著影響,而抑制Sesn2表達(dá)可顯著降低線粒體相關(guān)蛋白Drp1,PGC-1α及COX4表達(dá),并且使線粒體促融合、分裂蛋白Mfn2、Drp1比例失調(diào),融合指數(shù)升高。線粒體自噬蛋白Pink1表達(dá)下降,P62堆積增多。此外,抑制Sesn2表達(dá)還可增加肌管細(xì)胞內(nèi)ROS水平;(4)AMPK敲除小鼠骨骼肌Drp1表達(dá)無顯著變化,而Mfn2表達(dá)顯著下降,此外Pink1蛋白含量下降。研究結(jié)論:(1)長期有氧運(yùn)動(dòng)可延緩或改善老年小鼠增齡性骨骼肌萎縮發(fā)生、降低衰老骨骼肌中低炎癥反應(yīng)狀態(tài);(2)長期有氧運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞線粒體生成、改善線粒體功能、提高線粒體自噬、并降低異常線粒體的產(chǎn)生;(3)Sesn2可通過調(diào)節(jié)肌管細(xì)胞線粒體的多種功能、減少細(xì)胞ROS的產(chǎn)生,從而改善衰老過程中骨骼肌細(xì)胞線粒體異常;(4)AMPK可能介導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞Sesn2促進(jìn)細(xì)胞線粒體融合和線粒體自噬的作用。
【圖文】：

顯微鏡 日本奧林巴斯公司混旋儀 江蘇海門其林貝爾儀器有限公司動(dòng)物體成分分析測(cè)定儀 澳大利亞 ImpediVET 公司、大鼠氣體麻醉機(jī) 中國瑞沃德天平 瑞士梅特勒托利多公司制冰機(jī) 意大利 SCOTSMAN 公司機(jī) 德國 Eppendorf 公司.3 運(yùn)動(dòng)方案在適應(yīng)性訓(xùn)練 1 周后，老年運(yùn)動(dòng)組小鼠從 12 月齡 (中年階段) 開始運(yùn)至 20 月齡 (老年階段)，干預(yù)時(shí)長為 8 個(gè)月；此外，，雄性野生型以及 AMP敲除鼠，干預(yù)時(shí)長為 6 周。運(yùn)動(dòng)形式為 75% VO2max 強(qiáng)度的有氧跑臺(tái)運(yùn)/天，5 次/周。實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線如下所示：

差分析 (One-way ANOVA) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05 為各組間顯著差異性標(biāo)準(zhǔn)。1.2 結(jié)果1.2.1 小鼠體重和腓腸肌質(zhì)量Sarcopenia 主要表現(xiàn)為骨骼肌質(zhì)量與力量的下降，因此骨骼肌質(zhì)量的多少是衡量衰老個(gè)體是否發(fā)生 Sarcopenia 的重要指標(biāo)，目前認(rèn)為骨骼肌質(zhì)量與總體重的比值可用來反映 Sarcopenia 的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)在確保實(shí)驗(yàn)對(duì)象的基礎(chǔ)狀態(tài)一致的情況下，參照 Fernando 等人的小鼠跑臺(tái)速度及最大攝氧量對(duì)照表設(shè)計(jì)老年運(yùn)動(dòng)組小鼠的運(yùn)動(dòng)方案，以探求長期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠骨骼肌萎縮的改善作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 1-2 所示，從圖中可以看出兩組老年小鼠之間的總體重 (圖 1-2.A)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，且均高于青年組，但老年安靜組小鼠腓腸肌質(zhì)量與總體重的比值 (圖 1-2.B) 較青年組顯著下降 (P<0.05)，而老年運(yùn)動(dòng)組小鼠腓腸肌質(zhì)量與總體重的比值較老年安靜組小鼠顯著升高 (P<0.05)，說明長期規(guī)律且適量的有氧運(yùn)動(dòng)可有效延緩衰老過程中小鼠骨骼肌質(zhì)量丟失。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R746.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉效磊;牛燕媚;傅力;;自噬——運(yùn)動(dòng)改善胰島素抵抗的新機(jī)制[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2013年03期

本文編號(hào)：2600688