【摘要】：研究目的:隨著全球人口老齡化的迅速加劇,由增齡誘發(fā)的多種代謝性疾病越發(fā)受到關注。增齡性骨骼肌萎縮(指與年齡相關的漸進性骨骼肌丟失與功能下降)對老年人健康產生多種負面影響,而規(guī)律運動則可顯著延緩老年人骨骼肌萎縮,但其機制尚不明確。增齡性骨骼肌萎縮與骨骼肌細胞衰老密切相關,有學者認為異常線粒體在骨骼肌細胞內的堆積是促進骨骼肌細胞衰老的重要因素。在衰老過程中堆積的異常線粒體DNA、受損的線粒體蛋白、氧化呼吸鏈過度產生的活性氧(ROS)都可加速骨骼肌細胞衰老。此外,有研究發(fā)現(xiàn)在衰老骨骼肌細胞線粒體融合、分裂比例失衡,線粒體融合相對增多導致巨大線粒體的產生,并且由于線粒體自噬水平下降,受損線粒體無法及時清除,致使受損巨大線粒體對骨骼肌細胞產生嚴重破壞,這可能是增齡性骨骼肌萎縮的關鍵誘因之一。Sestrins是一類具有抗衰老作用的應激誘導蛋白,可通過其自身抗氧化作用清除細胞內多余的氧化自由基,并且調控細胞內AMPK,mTOR等能量感受信號蛋白,調節(jié)細胞代謝。此外,研究發(fā)現(xiàn)Sestrins與細胞自噬活動密切相關,而在衰老骨骼肌細胞由于受損線粒體大量堆積,因此Sestrins的抗氧化及促自噬功能可能在保護衰老骨骼肌受損線粒體中發(fā)揮重要作用,其具體調控機制亟需深入研究。本課題將重點探討Sestrins與衰老骨骼肌中線粒體的相互作用關系,以期為揭示Sestrins在運動改善增齡性骨骼肌萎縮的機制提供理論依據(jù)。研究方法:(1)動物模型:3月齡C57BL/6青年雄性小鼠(YS)8只,12月齡C57BL/6老年雄性小鼠16只,隨機分為老年安靜對照組(OS)、老年運動組(OE)。此外,選用3月齡雄性野生型以及AMPKα2基因敲除鼠各8只,隨機分為安靜組和運動組。運動干預結束后行肌力測試、體成分分析、稱量體重,隨后處死取材;(2)運動方案:老年運動組干預時間為8個月,AMPKα2基因敲除鼠運動組干預時間為6周,運動形式為75%VO_2max強度的有氧跑臺運動,坡度為0,60分/次,1次/天,5次/周;(3)體成分檢測:運動干預結束后使用“ImpediVET實驗動物體組成測定分析儀”輸出體質指數(shù),去脂體重,體脂含量等指標,隨后進行統(tǒng)計分析;(4)電鏡觀察:在小鼠處死后,迅速分離腓腸肌,經(jīng)2.5%戊二醛和1%鋨酸固定、酒精和丙酮梯度脫水、環(huán)氧樹脂包埋、制備超薄切片,并在30000倍視野下觀察線粒體形態(tài);(5)細胞培養(yǎng):C2C12肌原細胞經(jīng)含2%馬血清的1×DMEM誘導分化為肌管細胞,應用Sesn1-siRNA、Sesn2-siRNA干預細胞,采用活性氧檢測試劑盒檢測干預后細胞ROS水平,后提取細胞蛋白;(6)取小鼠腓腸肌,經(jīng)4%中性甲醛固定、酒精梯度脫水、石蠟包埋、制備5μm切片,而后組織進行HE染色,光鏡下觀察各組小鼠腓腸肌橫截面積;(7)Western blot法檢測骨骼肌組織或C2C12細胞Sesn1,Sesn2,Sesn3,pAMPK-Thr172,Drp1,Mfn2,Pink1,p62,PGC-1α,COX4,IL6及TNF-α蛋白表達水平。研究結果:(1)長期有氧運動對小鼠增齡過程中體重增加無顯著影響,但可增加老年小鼠腓腸肌與體重比、去脂體重、抓力、抓力與體重比、腓腸肌肌纖維橫截面積,降低脂肪含量,減少衰老骨骼肌中炎癥因子(TNF-α)的產生;(2)長期有氧運動可有效減少衰老骨骼肌中巨大線粒體的產生,同時增加線粒體功能相關蛋白Drp1,Mfn2,PGC-1α及COX4,以及線粒體自噬蛋白Pink1的表達,降低P62表達;(3)老年小鼠骨骼肌中Sesn1和Sesn2的表達量下降而Sesn3表達無顯著變化,其中抑制Sesn1表達對線粒體調節(jié)相關蛋白表達無顯著影響,而抑制Sesn2表達可顯著降低線粒體相關蛋白Drp1,PGC-1α及COX4表達,并且使線粒體促融合、分裂蛋白Mfn2、Drp1比例失調,融合指數(shù)升高。線粒體自噬蛋白Pink1表達下降,P62堆積增多。此外,抑制Sesn2表達還可增加肌管細胞內ROS水平;(4)AMPK敲除小鼠骨骼肌Drp1表達無顯著變化,而Mfn2表達顯著下降,此外Pink1蛋白含量下降。研究結論:(1)長期有氧運動可延緩或改善老年小鼠增齡性骨骼肌萎縮發(fā)生、降低衰老骨骼肌中低炎癥反應狀態(tài);(2)長期有氧運動可促進骨骼肌細胞線粒體生成、改善線粒體功能、提高線粒體自噬、并降低異常線粒體的產生;(3)Sesn2可通過調節(jié)肌管細胞線粒體的多種功能、減少細胞ROS的產生,從而改善衰老過程中骨骼肌細胞線粒體異常;(4)AMPK可能介導骨骼肌細胞Sesn2促進細胞線粒體融合和線粒體自噬的作用。
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顯微鏡 日本奧林巴斯公司混旋儀 江蘇海門其林貝爾儀器有限公司動物體成分分析測定儀 澳大利亞 ImpediVET 公司、大鼠氣體麻醉機 中國瑞沃德天平 瑞士梅特勒托利多公司制冰機 意大利 SCOTSMAN 公司機 德國 Eppendorf 公司.3 運動方案在適應性訓練 1 周后，老年運動組小鼠從 12 月齡 (中年階段) 開始運至 20 月齡 (老年階段)，干預時長為 8 個月；此外，，雄性野生型以及 AMP敲除鼠，干預時長為 6 周。運動形式為 75% VO2max 強度的有氧跑臺運/天，5 次/周。實驗技術路線如下所示：

差分析 (One-way ANOVA) 進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05 為各組間顯著差異性標準。1.2 結果1.2.1 小鼠體重和腓腸肌質量Sarcopenia 主要表現(xiàn)為骨骼肌質量與力量的下降，因此骨骼肌質量的多少是衡量衰老個體是否發(fā)生 Sarcopenia 的重要指標，目前認為骨骼肌質量與總體重的比值可用來反映 Sarcopenia 的嚴重程度。本實驗在確保實驗對象的基礎狀態(tài)一致的情況下，參照 Fernando 等人的小鼠跑臺速度及最大攝氧量對照表設計老年運動組小鼠的運動方案，以探求長期有氧運動對老年小鼠骨骼肌萎縮的改善作用。實驗結果如圖 1-2 所示，從圖中可以看出兩組老年小鼠之間的總體重 (圖 1-2.A)無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，且均高于青年組，但老年安靜組小鼠腓腸肌質量與總體重的比值 (圖 1-2.B) 較青年組顯著下降 (P<0.05)，而老年運動組小鼠腓腸肌質量與總體重的比值較老年安靜組小鼠顯著升高 (P<0.05)，說明長期規(guī)律且適量的有氧運動可有效延緩衰老過程中小鼠骨骼肌質量丟失。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R746.4

【參考文獻】

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1 劉效磊;牛燕媚;傅力;;自噬——運動改善胰島素抵抗的新機制[J];生理科學進展;2013年03期

本文編號：2600688