發(fā)布時(shí)間：2020-03-25 19:33

【摘要】：目的:神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic pain,NP)是一種臨床常見(jiàn)的疼痛疾病,其病因繁多,機(jī)制復(fù)雜。NP可由多種疾病引發(fā),不同于組織損傷所致的急性疼痛,其程度重、病程長(zhǎng),目前治療手段仍難以達(dá)到理想效果,因此關(guān)于其發(fā)病機(jī)制的研究一直是疼痛研究者的重要任務(wù)。疼痛發(fā)生過(guò)程中,神經(jīng)型一氧化氮合酶(Neuronal nitric oxide synthase,nNOS)、鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II,CaMKⅡ)CaMKⅡ、突觸后致密蛋白95(Post Synaptic Density protein PSD-95)等都參與了疼痛發(fā)生的過(guò)程。本研究以nNOS為切入點(diǎn),目的在于探究在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生的過(guò)程中nNOS在哪些位點(diǎn)發(fā)生了磷酸化,其磷酸化在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制起到了何種作用。同時(shí)也研究了CaMKⅡ及PSD-95與是否參與了nNOS磷酸化的過(guò)程。研究方法:所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(雄性SD大鼠共110只)隨機(jī)分為13組,分別為非手術(shù)組(Naive)(n=5)、假手術(shù)組(Sham)(n=20)、SNI手術(shù)后1天組(D1)(n=10)、SNI手術(shù)后3天組(D4)(n=10)、SNI手術(shù)后7天組(D7)(n=10)、SNI手術(shù)后10天組(D10)(n=20)、SNI手術(shù)后14天組(D14)(n=10)、DMSO+SNI手術(shù)組(DMSO)(鞘內(nèi)給藥:10ul/rat,n=10)、KN93+SNI手術(shù)組(KN93)(30uM/10ul/rat,n=10)、Wortmannin+SNI手術(shù)組(Wortmannin)(40uM/10ul/rat,n=5)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)前后均需測(cè)量下肢縮爪閾值(paw withdrawal threshold,PWT)。需要手術(shù)的實(shí)驗(yàn)鼠預(yù)先制作鞘內(nèi)置管模型,大鼠恢復(fù)7天之后制作坐骨神經(jīng)分支損傷(Spared nerve injury,SNI)模型。術(shù)后每日均采集PWT,于術(shù)后第1天開(kāi)始進(jìn)行鞘內(nèi)給藥,連續(xù)給藥至術(shù)后第10天。在各個(gè)對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)脊髓中CaMKⅡThr286自磷酸化水平(CaMKⅡ-T286)、CaMKⅡ蛋白表達(dá)量、PSD-95表達(dá)量。并通過(guò)2`-5`-ADP-agarose提純脊髓中的nNOS并檢測(cè)其中nNOS Ser1417磷酸化水平(nNOS-NP1417),nNOS Ser847磷酸化水平(nNOS-NP847),以及在nNOS沉淀樣品中CaMKⅡ Thr286自磷酸化水平(CaMKⅡ-T286)、CaMKⅡ蛋白表達(dá)量、PSD-95表達(dá)量。結(jié)果:第一部分:通過(guò)檢驗(yàn)nNOS不同位點(diǎn)磷酸化是否表達(dá),并通過(guò)KN-93及Wortmannin等抑制劑驗(yàn)證在NP過(guò)程中nNOS是否發(fā)生磷酸化以及不同位點(diǎn)磷酸化量與時(shí)間變化之間的關(guān)系。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)得出以下結(jié)果:SNI可令大鼠機(jī)械痛閾值降低(P0.05),nNOS Ser847以及Ser1417在疼痛過(guò)程中都發(fā)生磷酸化。但表達(dá)量最高時(shí)間點(diǎn)不同,在鞘內(nèi)分別給予KN-93及Wortmannin后,與之相應(yīng)的nNOS Ser847和Ser1417磷酸化明顯減少(P0.05)。第二部分:通過(guò)檢測(cè)脊髓中CaMKⅡ磷酸化的表達(dá)量并結(jié)合動(dòng)物形態(tài)學(xué)變化證明疼痛的發(fā)生是否與CaMKⅡ的活性有關(guān)。并通過(guò)Agaros共沉淀nNOS,檢測(cè)nNOS沉淀樣品中是否有CaMKⅡ以及PSD-95的表達(dá),判斷在NP發(fā)生過(guò)程中這幾種相關(guān)蛋白是否結(jié)合在一起。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)得出以下結(jié)果:在NP發(fā)生過(guò)程中,CaMKⅡ會(huì)發(fā)生Th 286自磷酸化從而被激活參與疼痛發(fā)生過(guò)程,表達(dá)量明顯增高(P0.05),其變化趨勢(shì)與疼痛行為學(xué)趨勢(shì)一致。在給予CaMKⅡ活性抑制劑KN-93后PWT明顯升高(P0.05)。而在nNOS沉淀樣品中檢測(cè)到了CaMKⅡ、CaMKⅡ自磷酸化、以及PSD-95的表達(dá)。并且通過(guò)計(jì)算結(jié)果發(fā)現(xiàn)CaMKⅡ自磷酸化的表達(dá)與PWT趨勢(shì)類似。而PSD-95和CaMKⅡ的表達(dá)趨勢(shì)也與疼痛行為學(xué)趨勢(shì)近似。而當(dāng)鞘內(nèi)注射KN-93后,nNOS沉淀樣品中CaMKⅡ,PSD-95的表達(dá)量明顯降低(P0.05).結(jié)果表明在NP產(chǎn)生的過(guò)程中CaMKⅡ與PSD-95及nNOS存在結(jié)合狀態(tài)并一起參與整個(gè)過(guò)程。并且與CaMKⅡ活性相關(guān)。結(jié)論:1、在大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型中,nNOS Ser847及Ser1417分別被CaMKⅡ、PKB/Akt磷酸化,使nNOS活性分別下調(diào)和上調(diào),導(dǎo)致NO合成量改變,對(duì)神經(jīng)病理性疼痛起到了不同的調(diào)節(jié)作用2、在神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生過(guò)程中,CaMKⅡ,PSD-95及nNOS存在結(jié)合狀態(tài),并且參與疼痛過(guò)程,這種結(jié)合狀態(tài)是CaMKⅡ磷酸化使nNOS Ser847磷酸化的關(guān)鍵。3、CaM-KⅡ與PSD-95可能通過(guò)調(diào)節(jié)nNOS磷酸化,從而在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。
【圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3.結(jié)果3.1 疼痛縮足閾值檢測(cè)結(jié)果各組SD大鼠縮足閾值的基礎(chǔ)值沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，制作SNI模型后，模型組的縮足閾值相比對(duì)照組和假手術(shù)組顯著降低，在1天時(shí)與術(shù)前相比已經(jīng)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.001），10天組的縮足閾值最低，而從14天開(kāi)始，縮足閾值有逐漸增加的趨勢(shì)。模型組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)之間相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)圖1（***P<0.001）。

對(duì)各個(gè)樣本中所含nNOS Ser847磷酸化程度的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后10天時(shí)，磷酸化的程度最高，與術(shù)前相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（P<0.001），在10天后，，Ser847的磷酸化水平有逐漸減少的趨勢(shì)。見(jiàn)圖2.2A（*P<0.001）3.2.2 神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓 nNOS Ser1417 的磷酸化表達(dá)情況對(duì)各個(gè)樣本中所含的nNOS Ser1417的磷酸化進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在疼痛發(fā)生后，磷酸化量迅速上升。術(shù)后第一天磷酸化程度最強(qiáng)，與術(shù)前相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的組間統(tǒng)計(jì)沒(méi)有明顯差異（P>0.05）。見(jiàn)圖2.2 B（*P<0.05）
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R741

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本文編號(hào)：2600335