【摘要】：目的:神經病理性疼痛(Neuropathic pain,NP)是一種臨床常見的疼痛疾病,其病因繁多,機制復雜。NP可由多種疾病引發(fā),不同于組織損傷所致的急性疼痛,其程度重、病程長,目前治療手段仍難以達到理想效果,因此關于其發(fā)病機制的研究一直是疼痛研究者的重要任務。疼痛發(fā)生過程中,神經型一氧化氮合酶(Neuronal nitric oxide synthase,nNOS)、鈣離子/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II,CaMKⅡ)CaMKⅡ、突觸后致密蛋白95(Post Synaptic Density protein PSD-95)等都參與了疼痛發(fā)生的過程。本研究以nNOS為切入點,目的在于探究在神經病理性疼痛發(fā)生的過程中nNOS在哪些位點發(fā)生了磷酸化,其磷酸化在神經病理性疼痛的發(fā)病機制起到了何種作用。同時也研究了CaMKⅡ及PSD-95與是否參與了nNOS磷酸化的過程。研究方法:所有實驗動物(雄性SD大鼠共110只)隨機分為13組,分別為非手術組(Naive)(n=5)、假手術組(Sham)(n=20)、SNI手術后1天組(D1)(n=10)、SNI手術后3天組(D4)(n=10)、SNI手術后7天組(D7)(n=10)、SNI手術后10天組(D10)(n=20)、SNI手術后14天組(D14)(n=10)、DMSO+SNI手術組(DMSO)(鞘內給藥:10ul/rat,n=10)、KN93+SNI手術組(KN93)(30uM/10ul/rat,n=10)、Wortmannin+SNI手術組(Wortmannin)(40uM/10ul/rat,n=5)。所有實驗動物手術前后均需測量下肢縮爪閾值(paw withdrawal threshold,PWT)。需要手術的實驗鼠預先制作鞘內置管模型,大鼠恢復7天之后制作坐骨神經分支損傷(Spared nerve injury,SNI)模型。術后每日均采集PWT,于術后第1天開始進行鞘內給藥,連續(xù)給藥至術后第10天。在各個對應時間點檢測脊髓中CaMKⅡThr286自磷酸化水平(CaMKⅡ-T286)、CaMKⅡ蛋白表達量、PSD-95表達量。并通過2`-5`-ADP-agarose提純脊髓中的nNOS并檢測其中nNOS Ser1417磷酸化水平(nNOS-NP1417),nNOS Ser847磷酸化水平(nNOS-NP847),以及在nNOS沉淀樣品中CaMKⅡ Thr286自磷酸化水平(CaMKⅡ-T286)、CaMKⅡ蛋白表達量、PSD-95表達量。結果:第一部分:通過檢驗nNOS不同位點磷酸化是否表達,并通過KN-93及Wortmannin等抑制劑驗證在NP過程中nNOS是否發(fā)生磷酸化以及不同位點磷酸化量與時間變化之間的關系。經過試驗得出以下結果:SNI可令大鼠機械痛閾值降低(P0.05),nNOS Ser847以及Ser1417在疼痛過程中都發(fā)生磷酸化。但表達量最高時間點不同,在鞘內分別給予KN-93及Wortmannin后,與之相應的nNOS Ser847和Ser1417磷酸化明顯減少(P0.05)。第二部分:通過檢測脊髓中CaMKⅡ磷酸化的表達量并結合動物形態(tài)學變化證明疼痛的發(fā)生是否與CaMKⅡ的活性有關。并通過Agaros共沉淀nNOS,檢測nNOS沉淀樣品中是否有CaMKⅡ以及PSD-95的表達,判斷在NP發(fā)生過程中這幾種相關蛋白是否結合在一起。經過試驗得出以下結果:在NP發(fā)生過程中,CaMKⅡ會發(fā)生Th 286自磷酸化從而被激活參與疼痛發(fā)生過程,表達量明顯增高(P0.05),其變化趨勢與疼痛行為學趨勢一致。在給予CaMKⅡ活性抑制劑KN-93后PWT明顯升高(P0.05)。而在nNOS沉淀樣品中檢測到了CaMKⅡ、CaMKⅡ自磷酸化、以及PSD-95的表達。并且通過計算結果發(fā)現CaMKⅡ自磷酸化的表達與PWT趨勢類似。而PSD-95和CaMKⅡ的表達趨勢也與疼痛行為學趨勢近似。而當鞘內注射KN-93后,nNOS沉淀樣品中CaMKⅡ,PSD-95的表達量明顯降低(P0.05).結果表明在NP產生的過程中CaMKⅡ與PSD-95及nNOS存在結合狀態(tài)并一起參與整個過程。并且與CaMKⅡ活性相關。結論:1、在大鼠神經病理性疼痛模型中,nNOS Ser847及Ser1417分別被CaMKⅡ、PKB/Akt磷酸化,使nNOS活性分別下調和上調,導致NO合成量改變,對神經病理性疼痛起到了不同的調節(jié)作用2、在神經病理性疼痛產生過程中,CaMKⅡ,PSD-95及nNOS存在結合狀態(tài),并且參與疼痛過程,這種結合狀態(tài)是CaMKⅡ磷酸化使nNOS Ser847磷酸化的關鍵。3、CaM-KⅡ與PSD-95可能通過調節(jié)nNOS磷酸化,從而在神經病理性疼痛發(fā)病機制中發(fā)揮作用。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學碩士學位論文3.結果3.1 疼痛縮足閾值檢測結果各組SD大鼠縮足閾值的基礎值沒有統(tǒng)計學差異，制作SNI模型后，模型組的縮足閾值相比對照組和假手術組顯著降低，在1天時與術前相比已經有明顯統(tǒng)計學差異（P<0.001），10天組的縮足閾值最低，而從14天開始，縮足閾值有逐漸增加的趨勢。模型組術后各時間點之間相比，無統(tǒng)計學差異。見圖1（***P<0.001）。

對各個樣本中所含nNOS Ser847磷酸化程度的檢測發(fā)現，在術后10天時，磷酸化的程度最高，與術前相比有統(tǒng)計學顯著差異（P<0.001），在10天后，，Ser847的磷酸化水平有逐漸減少的趨勢。見圖2.2A（*P<0.001）3.2.2 神經病理性疼痛大鼠脊髓 nNOS Ser1417 的磷酸化表達情況對各個樣本中所含的nNOS Ser1417的磷酸化進行測定，發(fā)現在疼痛發(fā)生后，磷酸化量迅速上升。術后第一天磷酸化程度最強，與術前相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），術后各時間點的組間統(tǒng)計沒有明顯差異（P>0.05）。見圖2.2 B（*P<0.05）
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R741

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本文編號：2600335