【摘要】：研究背景中樞神經系統(tǒng)(central nervous system,CNS)細菌感染累及腦膜及腦實質,是一類嚴重并難治的疾病。細菌性腦膜炎是易發(fā)生在嬰幼兒時期的中樞神經系統(tǒng)感染性疾病,其中肺炎鏈球菌是我國最常見的細菌性腦膜炎的致病菌之一,也是導致神經系統(tǒng)后遺癥的主要病原菌。盡管近年來有效抗生素的及時合理應用以及預防接種的大范圍推行使得細菌性腦膜炎病死率較前有所降低,但神經系統(tǒng)相關后遺癥如精神運動發(fā)育遲滯、智力損害、聽神經損傷等仍居高不下,嚴重影響著幸存患兒的身心健康,給個人家庭和社會帶來了極大的負擔。固有免疫是機體免疫系統(tǒng)直接抵御病原體入侵的最初階段,通過機體自身的特異性模式識別受體識別病原體特有的保守結構,即病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),在宿主防御病原體侵襲中起到重要作用。核苷酸結合寡聚化結構域NOD樣受體(NLRs)家族為胞漿內模式識別受體,迄今發(fā)現(xiàn)包括3個亞家族:核苷酸結合寡聚化結構域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD),核苷酸結合寡聚化結構域受體熱蛋白(NOD-like receptor family pyrin domain-containing,NALP),神經元細胞凋亡抑制蛋白(neuronal apoptosis inhibitory protein,NAIP)。其中,NOD蛋白能夠識別細菌細胞壁的成分——細菌肽聚糖(peptidoglycan peptidoglycan,PGN),活化NF-κB,參與針對病原相關受體的固有免疫和炎性反應。做為最具代表性的NOD蛋白家族成員,NOD1識別大多數(shù)革蘭氏陰性菌和某些革蘭氏陽性細菌PGN上含有meso-二胺基庚二酸(meso-DAP)的胞壁酰肽,而NOD2識別在所有細菌PGN上所產生的胞壁酰二肽(muramyldipeptide,MDP)。當NOD2識別細菌細胞壁的MDP,NOD2發(fā)生構象改變,募集活化受體相互作用蛋白 2(receptor-interacting protein2,RIP2/RICK/CARDIAK),誘導 NF-κB轉運至細胞核并轉錄促炎癥基因,引發(fā)炎癥反應,導致細胞因子、趨化因子以及抗微生物肽的產生。RIP2是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,歸類為RIP家族的成員之一。RIP2的N端含有一個絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域,在信號轉導途徑中發(fā)揮關鍵作用,RIP2受到刺激后,176位絲氨酸及474位酪氨酸發(fā)生自磷酸化,促進RIP2表達。多個炎癥免疫調節(jié)異常及相關疾病的實例證明它們源于NOD2/RIP2的過度活化。而且,RIP2的激酶活性是NOD2發(fā)揮功能所必備的一部分,多個研究證明調節(jié)RIP2的表達及176位絲氨酸的自磷酸化是NOD2誘導細胞因子免疫應答不可或缺的。雖然RIP2做為NOD銜接蛋白的作用及泛素化理論已經建立,但是RIP2作為激酶的生物學作用仍待研究。是否可以通過調節(jié)RIP2的激酶活性減輕炎癥反應及炎癥造成的損傷,成為新的治療靶點。吉非替尼是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGF-R)的ATP競爭性激酶抑制劑,且作為含有EGF-R變異的非小細胞性肺癌患者的一線臨床藥物。在放射性體外激酶測定及組織培養(yǎng)實驗中證明了吉非替尼使得RIP2自磷酸化失敗,這表明吉非替尼在體外表現(xiàn)出抑制RIP2的作用,從而降低了 RIP2的表達以及NOD刺激后細胞因子的產生。但尚未有體內試驗證明相同的作用。目的通過建立幼鼠感染性腦膜炎動物模型,探索形成細菌性腦膜炎的有效菌液濃度,模擬肺炎鏈球菌感染所致細菌性腦膜炎時,中樞神經系統(tǒng)受到炎癥刺激后所形成的反應體系,主要目標在于探究中樞神經系統(tǒng)免疫作用細胞的功能并驗證肺炎鏈球菌是NOD2/RIP2的有效刺激因子;通過對肺炎鏈球菌感染小鼠神經細胞的NOD2/RIP2與NF-κB下游信號通路的檢測,分析RIP2作為NOD銜接蛋白的作用及泛素化理論;進一步探究RIP2抑制劑吉非替尼對細菌性腦膜炎細胞因子的影響,觀察它對炎癥后腦損傷的保護作用,更好的了解RIP2在肺炎鏈球菌性腦膜炎中的激酶活性并探究RIP2作為治療靶向蛋白的可能證明吉非替尼作為RIP2的抑制劑在肺炎鏈球菌性腦膜炎所致細菌性炎癥的治療可能。方法1.出生6-8周C57BL/6野生雄性小鼠66只,體重22-28g,隨機將動物分為對照組(6只)和試驗組(60只),其中試驗組根據(jù)細菌菌液的不同接種濃度劃分為三個亞組,即低濃度組(0.5×107cfu/uL)、中濃度組(0.5×108cfu/uL)及高濃度組(0.5×109cfu/uL),每亞組20只動物。每日按規(guī)定時間觀察接種后各組小鼠的臨床表現(xiàn)并評分記錄;于接種后0小時、24小時、48小時、72小時及120小時處死每組小鼠各4只,用于病理學觀察及腦勻漿細菌培養(yǎng)測定。2.建立肺炎鏈球菌腦膜炎動物模型,觀察小鼠的臨床表現(xiàn)并取腦勻漿進行細菌培養(yǎng),計數(shù)肺炎鏈球菌菌落;HE染色用以觀察腦膜和腦組織形態(tài)學改變;用免疫組織化學技術觀測P-RIP2在小鼠腦組織中的定位及表達;用免疫蛋白印跡技術(Western-blot)檢測腦組織中NOD2、RIP2的表達變化規(guī)律。3.將64只C57BL/6野生雄性小鼠隨機分為生理鹽水組(NS)、肺炎鏈球菌腦膜炎組(SP)、抑制劑組(Gefitinib)和溶媒組(DMSO)。每組16只小鼠。采用側腦室注射肺炎鏈球菌細菌懸液/生理鹽水;腹腔注射吉非替尼/溶媒DMSO的方法建立模型。建模后置籠中飼養(yǎng),觀察臨床表現(xiàn)。于建模后72小時處死動物,立即取腦組織備用。免疫組織化學技術觀察P-RIP2在各組腦組織中的表達;用免疫蛋白印跡技術(Western-blot)檢測腦組織中NOD2、RIP2、P-RIP2及NF-κB的表達變化;用實時反轉錄聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)檢測各組小鼠腦組織中目的蛋白(NOD2/RIP2)的相對表達水平。4.將64只C57BL/6雄性小鼠隨機分為生理鹽水組(NS)、肺炎鏈球菌腦膜炎組(SP)、抑制劑組(Gefitinib)和溶媒組(DMSO)。每組16只小鼠。于建模后72小時處死動物,采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測腦組織中細胞因子IL-6、TNF-α的濃度變化;將小鼠腦組織行HE染色以觀測腦膜和腦組織形態(tài)學改變;采取雙盲法兩人定時對小鼠進行臨床癥狀評分。結果1.無論接種濃度高低,所有試驗組小鼠在接種細菌懸液后,均出現(xiàn)了腦損傷的癥狀,其中高濃度組小鼠在接種細菌懸液120小時全部死亡。對照組小鼠麻醉蘇醒后一般情況良好,精神進食均好,恢復較快,無腦損傷癥狀出現(xiàn)。所有試驗組小鼠腦勻漿均培養(yǎng)出與接種同株的肺炎鏈球菌,細菌滴度與接種濃度無密切相關。對照組小鼠的腦勻漿無細菌生長。大體觀察,試驗組小鼠可見腦組織體積增大、血管充血、腦回明顯增寬、腦溝變淺。而對照組小鼠的腦組織無上述變化。HE染色病理學觀察,對照組未見明顯炎性細胞浸潤。試驗組在接種細菌懸液24小時其腦室周圍、海馬區(qū)即出現(xiàn)少許炎性細胞浸潤,接種細菌72小時可見蛛網膜下隙呈炎性改變,HE染色可見軟腦膜血管擴張,蛛網膜下隙膨脹,內顆粒層神經元腫脹,呈氣球樣變性,海馬及其腦室周圍可見中性粒細胞浸潤。2.生理鹽水組大腦皮質NOD2/RIP2/P-RIP2蛋白表達較低,而肺炎鏈球菌腦膜炎組NOD2/RIP2/P-RIP2蛋白表達顯著升高,于感染初期即建模后24小時內即有升高,且呈時效性變化,至72小時最為顯著,120小時呈持續(xù)平穩(wěn)升高趨勢。皮層NF-κB蛋白水平于肺炎鏈球菌刺激誘導后72小時明顯升高,與建模0小時相比較有顯著性差異。P-RIP2免疫反應陽性細胞遍及肺炎鏈球菌腦膜炎小鼠的皮層神經元、膠質細胞。3.肺炎鏈球菌腦膜炎組及溶媒組小鼠大腦皮層及海馬區(qū)可見廣泛表達的P-RIP2免疫陽性細胞,明顯高于生理鹽水組;而吉非替尼組小鼠P-RIP2免疫陽性細胞明顯低于肺炎鏈球菌腦膜炎組。Western-blot結果顯示,小鼠腦組織中NOD2、RIP2、P-RIP2及NF-κB蛋白在肺炎鏈球菌腦膜炎組及溶媒組小鼠明顯升高,與生理鹽水組相較,差異顯著(P0.01);而與肺炎鏈球菌腦膜炎組小鼠相比,吉非替尼明顯降低了 P-RIP2的表達,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。且吉非替尼組小鼠NF-κB蛋白表達明顯降低,與肺炎鏈球菌組比較,有顯著性差異(P0.05)。肺炎鏈球菌腦膜炎組小鼠皮層NOD2 mRNA的表達較生理鹽水組明顯上升,相比有顯著差異(P0.05)。而吉非替尼組小鼠皮層NOD2 mRNA水平與肺炎鏈球菌腦膜炎組比較無顯著差異(P0.05)。RIP2 mRNA在生理鹽水組小鼠皮層的表達水平較肺炎鏈球菌腦膜炎組小鼠明顯升高,相較有顯著性差異(P0.05)。而肺炎鏈球菌腦膜炎組與吉非替尼組二者相較無顯著性差異(P0.05)。4.ELISA法檢測結果表明NOD2-RIP2信號通路激活后能促使細胞因子IL-6、TNF-α的分泌上升,且呈時效性增長,即炎癥刺激后72小時內呈現(xiàn)遞增的趨勢。各組間比較,吉非替尼組小鼠IL-6、TNF-α含量顯著低于肺炎鏈球菌腦膜炎組、溶媒組小鼠(P0.05),但仍高于生理鹽水組(P0.05)。光鏡觀察:肺炎鏈球菌腦膜炎組、溶媒組小鼠腦組織可見軟腦膜血管擴張,蛛網膜下隙膨脹,內顆粒層神經元腫脹,呈氣球樣變性,軟腦膜及其腦室周圍可見中性粒細胞浸潤,出血壞死灶。吉非替尼組小鼠腦組織細胞腫脹、空泡變性較肺炎鏈球菌腦膜炎組、溶媒組少,腦皮質結構完整,海馬區(qū)細胞排列基本整齊,血管間隙略增寬,可見少量炎癥細胞浸潤。生理鹽水組細胞形態(tài)規(guī)整,大小一致,無炎癥反應和神經元損傷存在。肺炎鏈球菌腦膜炎組、溶媒組小鼠出現(xiàn)精神萎靡、嗜睡,皮毛粗糙,嘔吐,反應遲緩,運動失調、抽搐、角弓反張等腦損傷癥狀較吉非替尼組明顯增加。生理鹽水組小鼠麻醉蘇醒后一般情況良好,精神進食均好,恢復較快,無上述癥狀出現(xiàn)。結論1.C57BL/6小鼠經側腦室注射可以成功建立感染性腦膜炎動物模型,經檢測小鼠神經病理學改變,可以更加貼切的反應人類嬰幼兒腦膜炎的發(fā)生、發(fā)展過程,進而為研究腦損傷的發(fā)生機理提供可靠的實驗依據(jù)。2.肺炎鏈球菌感染致使NOD2顯著增加,提示NOD2參與細菌炎癥免疫反應的啟動。驗證了肺炎鏈球菌是NOD2-RIP2信號通路的有效刺激因子,即胞內NOD2-RIP2-NF-κB/MAPKs信號通路在細菌及其代謝產物作用于細胞內的炎性反應中發(fā)揮著重要的功能。3.吉非替尼可以通過抑制RIP2磷酸化以減少體內RIP2的表達,提示通過抑制RIP2磷酸化或是吉非替尼發(fā)揮保護性作用的原因。4.在RIP2抑制作用下,巨噬細胞分泌的炎癥細胞因子,即腫瘤壞死因子(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)明顯減少,有效緩解肺炎鏈球菌所致的腦損傷。意義本研究表明,通過向小鼠側腦室內注入肺炎鏈球菌菌液可以成功誘導出細菌性腦膜炎。當細菌性腦膜炎發(fā)生時,腦組織NOD2-RIP2表達顯著上升,提示NOD2-RIP2-NF-κB/MAPKs信號通路參與細菌炎癥免疫反應的啟動,促進炎癥的形成和發(fā)展。抑制劑吉非替尼能抑制RIP2的磷酸化,減輕腦水腫,保護神經元免受炎性損傷。上述結論啟示RIP2或是調節(jié)炎癥性疾病的一個可行的藥理學靶點,在未來的細菌性腦膜炎治療中,為防治細菌性腦膜炎及其它中樞神經系統(tǒng)感染性疾病提供了借鑒。
【圖文】：

圖１．邋１不同菌液濃度引起試驗組小鼠的抽搐率（＊Ｋ0．邋０５）逡逑

圖１．邋２菌液濃度對生存率的影響逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R742.9

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本文編號：2598485