【摘要】：PRRT2相關(guān)疾病(PRRT2-associated disorders)是以PRRT2基因變異為共同分子基礎(chǔ)的一類常染色體顯性遺傳性疾病,主要包括發(fā)作性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙(paroxysmal kinesigenic dyskinesia,PKD)、良性家族性嬰兒癲癇(benign familial infantile seizures,BFIS)、嬰兒驚厥伴舞蹈手足徐動(dòng)癥(infantile convulsions with choreoathetosis,ICCA)、偏癱性偏頭痛(hemiplegicmigraine,HM)、發(fā)作性共濟(jì)失調(diào)(episodicataxia,EA)等。原發(fā)性 PKD是PRRT2相關(guān)疾病最常見(jiàn)的表型。目前為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 100多種PRRT2變異,包括無(wú)義變異、錯(cuò)義變異、小片段插入/缺失、剪切位點(diǎn)變異等。90%以上變異可導(dǎo)致終止密碼提前出現(xiàn),是PRRT2基因最常見(jiàn)的致病變異類型。攜帶錯(cuò)義變異的病例遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于攜帶截短變異的病例,對(duì)錯(cuò)義變異蛋白的功能研究也寥寥無(wú)幾,多數(shù)錯(cuò)義變異與PRRT2相關(guān)疾病的關(guān)系仍不明確,給疾病的診治帶來(lái)困難。PRRT2是中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性表達(dá)的膜蛋白,通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元的突觸傳遞和Na+離子通道功能影響神經(jīng)元的興奮性。截短變異導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平下降,亞細(xì)胞定位異常。單倍體劑量不足可能是PRRT2相關(guān)疾病發(fā)生的病理機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)2種錯(cuò)義變異(p.A287T和p.R308C)的蛋白表達(dá)下降或彌散到細(xì)胞漿中。我們團(tuán)隊(duì)前期對(duì)另2種錯(cuò)義變異(p.R266W和p.G305R)的研究則未發(fā)現(xiàn)這種改變。2016年,我們團(tuán)隊(duì)利用PKD患者尿上皮細(xì)胞構(gòu)建了誘導(dǎo)多能干(inducedpluripotentstem,iPS)細(xì)胞,但發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞向神經(jīng)元分化的周期長(zhǎng),分化效率較低。有文獻(xiàn)表明,iPS細(xì)胞攜帶其原始體細(xì)胞的表觀遺傳記憶,可能對(duì)分化等細(xì)胞特性有一定影響。目前報(bào)道的PKD患者iPS細(xì)胞模型的原始體細(xì)胞多為皮膚成纖維細(xì)胞。本研究中,我們對(duì)2017年12月以前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的PRRT2錯(cuò)義變異進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn),根據(jù) American Col lege of Medical Genetics and Genomics(ACMG)指南對(duì)錯(cuò)義變異位點(diǎn)的性質(zhì)進(jìn)行判定。對(duì)于PRRT2編碼區(qū)檢測(cè)陰性的PKD患者,我們進(jìn)一步篩查PRRT2調(diào)控區(qū)域序列的變異,并進(jìn)行相關(guān)的功能實(shí)驗(yàn),以探討這些變異的致病性。同時(shí),我們從變異蛋白的降解角度對(duì)PRRT2致病機(jī)制進(jìn)行初步探索,并培養(yǎng)攜帶PRRT2熱點(diǎn)變異患者的皮膚成纖維細(xì)胞,重編程為iPS細(xì)胞,為進(jìn)一步探索PRRT2的病理機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。第一部分PR尺T2錯(cuò)義變異的致病性分析目的:通過(guò)體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn),評(píng)估PRRT2相關(guān)疾病中發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義變異的致病性。方法:對(duì)2017年12月之前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的PRRT2錯(cuò)義變異進(jìn)行系統(tǒng)性文獻(xiàn)回顧和總結(jié)。構(gòu)建N端含EGFP的真核表達(dá)載體,進(jìn)行體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。免疫印跡法觀察PRRT2蛋白水平變化,在共聚焦顯微鏡下觀察蛋白亞細(xì)胞定位變化。根據(jù)ACMG指南分析變異的致病性。結(jié)果:PRRT2錯(cuò)義變異共29個(gè)。有10個(gè)錯(cuò)義變異蛋白同時(shí)存在蛋白水平減低和蛋白異位,3個(gè)變異僅改變蛋白的細(xì)胞膜定位,2個(gè)變異僅出現(xiàn)蛋白表達(dá)水平減低。經(jīng)過(guò)ACMG分類,有 15 個(gè)變異(p.S275F、p.P279L、p.W281R、p.A287T、p.A291V、p.R295Q、p.G305W、p.A306T、p.A306D、p.R308C、p.S317N、p.G323R、p.G323E、p.G324R 和 p.G324E)為可能致病變異,3個(gè)變異(p.P138A、p.D147H和p.P216L)為良性變異,3個(gè)變異(p.S208Y、p.A214P 和 p.P215R)為可能良性變異,而 8 個(gè)變異(p.E177K、p.P216R、p.P216H、p.R266W、p.R266Q、p.G305R、p.R311W 和 p.I327M)為意義未明確變異。結(jié)論:在已報(bào)道的PRRT2錯(cuò)義變異中,51.7%(15/29)的變異可以導(dǎo)致PRRT2相關(guān)疾病。致病性變異主要集中在PRRT2蛋白C端,提示該區(qū)域具有重要的生理功能。第二部分PRRT2基因UTR變異在PKD中的作用探討目的:對(duì)P尺RT2編碼區(qū)檢測(cè)陰性的PKD患者篩查PRRT2 UTR變異,并探討其致病性。方法:收集PRRT2編碼區(qū)測(cè)序陰性的PKD病例85例,篩查UTR變異。然后構(gòu)建包含UTR變異的質(zhì)粒表達(dá)載體,進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA水平變化,免疫印跡法檢測(cè)蛋白水平的改變。結(jié)果:在85例先證者中,分別在2例患者的3'UTR檢測(cè)到了 c.*933AG和c.*978AG雜合變異,5'UTR未檢測(cè)出異常。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),3'UTR可以明顯下調(diào)mRNA水平,進(jìn)而下調(diào)蛋白的表達(dá)。而c.*933AG和c.*978AG變異減弱了 3'UTR的下調(diào)能力,在一定程度上調(diào)了 PRRT2的mRNA和蛋白水平。結(jié)論:PRRT2蛋白功能增加也可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。對(duì)于PRRT2編碼區(qū)檢測(cè)陰性的PKD患者,還需進(jìn)一步篩查UTR變異。第三部分PRRT2變異蛋白的致病機(jī)制初步探索目的:初步探討PRRT2變異蛋白的致病機(jī)制,并建立人成纖維細(xì)胞來(lái)源的攜帶PRRT2熱點(diǎn)致病變異的iPS細(xì)胞模型。方法:將PRRT2熱點(diǎn)致病變異及野生型表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,用蛋白酶體或溶酶體降解抑制劑乳胞素或3-MA分別進(jìn)行干預(yù),用免疫印跡法檢測(cè)PRRT2蛋白變化。利用液相色譜-質(zhì)譜分析聯(lián)合免疫共沉淀尋找可能參與PRRT2降解的關(guān)鍵蛋白。培養(yǎng)攜帶PRRT2熱點(diǎn)致病變異的人皮膚成纖維細(xì)胞,利用仙臺(tái)病毒重編程試劑盒建立iPS細(xì)胞模型,分化為神經(jīng)元,免疫印跡法檢測(cè)神經(jīng)元中PRRT2蛋白水平的改變。結(jié)果:乳胞素和3-MA分別干預(yù)后,PRRT2變異蛋白增加較野生型蛋白都增多。PRRT2變異蛋白通過(guò)蛋白酶體和溶酶體途徑降解。PRRT2與E3泛素連接酶AMFR存在相互作用。成功構(gòu)建攜帶PRRT2熱點(diǎn)致病變異的源于人皮膚成纖維細(xì)胞的iPS細(xì)胞,并分化為神經(jīng)元,蛋白水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PRRT2變異蛋白顯著下降。結(jié)論:PRRT2變異蛋白降解增多導(dǎo)致蛋白水平的下降。攜帶PRRT2熱點(diǎn)致病變異的源于人皮膚成纖維細(xì)胞的iPS細(xì)胞是研究PRRT2病理機(jī)制的理想模型之一。
【圖文】：

１．２錯(cuò)義變異對(duì)蛋白定位的影響。Ａ、將Ｎ端融合了邋ＥＧＦＰ標(biāo)簽的尸／＾７７野和各變異型表徸載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Ｈｅｌａ細(xì)胞，３６邋ｈ后將細(xì)胞固定，，用偶聯(lián)Ａｌｅｘａ邋Ｆｌｕｏｒ邋５９ＷＧＡ染色，在共聚焦顯微鏡下觀察野生型及各變異型的定位。比例尺：５邋ｐｍ。Ｂ、５個(gè)細(xì)胞的綠色熒光細(xì)胞膜與細(xì)胞漿的ＩＯＤ比值，以野生型比值為１，數(shù)據(jù)以平均值準(zhǔn)差（ｘ±ｓ）表示，＊＊＊ｐ＜０．００１。逡逑．３．５邐錯(cuò)義變異的致病性再分類逡逑細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)提示良性變異不改變蛋白水平及細(xì)胞定位，在一定程度上也證實(shí)了正的ＰＲＲＴ２蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞膜定位對(duì)維持其生理功能的重要作用。結(jié)合功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果，逡逑們?cè)俅螌?duì)２９個(gè)變異進(jìn)行ＡＣＭＧ分類。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有１５個(gè)變異（ｐ．Ｓ２７５Ｆ、ｐ．Ｐ２７９Ｌ、逡逑．邋Ｗ２８１Ｒ、ｐ．Ａ２８７Ｔ、ｐ．邋Ａ２９１Ｖ、ｐ．Ｒ２９５Ｑ、ｐ．Ｇ３０５邋Ｗ、ｐ．邋Ａ３０６Ｔ、ｐ．邋Ａ３０６Ｄ、ｐ．Ｒ３０８Ｃ、ｐ．Ｓ３１７Ｎ、逡逑．Ｇ３２３Ｒ、ｐ．Ｇ３２３Ｅ、ｐ．Ｇ３２４Ｒ邋和邋ｐ．Ｇ３２４Ｅ）為可能致病變異，３邋個(gè)變異（ｐ＿Ｐ１３８Ａ、ｐ．Ｄ１４７Ｈ

邐意義未明確逡逑注釋：結(jié)合本研究中的功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)行ＡＣＭＧ分類。逡逑我們繪制了抑及乃野生型及２９種變異型基因和蛋白結(jié)構(gòu)模式圖（圖１．３），用綠色字逡逑體表示良性及可能良性變異，紅色表示可能致病變異，黑色表示意義未明確的變異。由圖逡逑可知
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R741

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2 熊永紅;胡莉;嚴(yán)樹(shù)涓;李

本文編號(hào)：2593782