【摘要】：背景:多發(fā)性硬化(multiple sclersosis,MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)脫髓鞘為特點(diǎn)的自身免疫性疾病,特征性病理改變包括炎性細(xì)胞浸潤、髓鞘結(jié)構(gòu)破壞、軸索損傷和膠質(zhì)細(xì)胞增生。近年來臨床上主要采用免疫抑制劑治療MS,已取得一定短期療效,但長期治療效果仍然不佳。盡管大部分免疫抑制劑能夠抑制免疫系統(tǒng)對CNS的攻擊,但對已發(fā)生的神經(jīng)損傷卻未能有效修復(fù),導(dǎo)致病情進(jìn)行性加重。研究表明,鉀離子Kv1.3通道在MS中的表達(dá)大量增加,Kv1.3通道已成為治療MS的潛在靶點(diǎn)。Kv1.3電壓門控鉀通道是Kv1.x亞家族中的一員,存在于免疫細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞胞膜上,對調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的生理功能起著重要作用。T細(xì)胞受到自身抗原的反復(fù)激活后,穿過血腦屏障,引起CNS炎癥反應(yīng),是MS形成的重要原因之一。在此過程中,T細(xì)胞Kv1.3通道的表達(dá)大量增加。雖然已有研究證實(shí)Kv1.3通道阻斷劑可以緩解MS大鼠模型的發(fā)病癥狀,但是Kv1.3通道阻斷劑的研究大多集中在抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)上,對其參與中樞神經(jīng)保護(hù)和調(diào)節(jié)其它免疫細(xì)胞功能方面的研究較少。小膠質(zhì)細(xì)胞作為CNS固有免疫細(xì)胞也參與了 MS的發(fā)生發(fā)展,在MS中,小膠質(zhì)細(xì)胞被激活并伴隨Kv1.3通道表達(dá)顯著增加,但小膠質(zhì)細(xì)胞炎性活化與Kv1.3通道表達(dá)變化的關(guān)聯(lián)和具體機(jī)制仍不明確。前期工作中,我們篩選出了一種高效特異性的Kv1.3通道阻斷劑ImKTx88,本課題將研究其在MS的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠中的神經(jīng)保護(hù)作用,并進(jìn)一步探討ImKTx88抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎性活化,減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷的效應(yīng)和分子機(jī)制,為MS的治療提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的:研究Kv1.3阻斷劑ImKTx88在EAE大鼠中的神經(jīng)保護(hù)作用,并揭示ImKTx88是如何通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎性活化,進(jìn)而減輕其損傷神經(jīng)細(xì)胞的潛在機(jī)制。方法:(1)將腦脊髓勻漿于第0天和第7天兩次免疫SD大鼠建立EAE模型。大鼠被隨機(jī)分為對照組、EAE組和ImKTx88治療組。第12天,按照100 μg/kg的劑量每天皮下注射ImKTx88(治療組)或同等體積的PBS(對照組和EAE組)。采用雙盲法觀察并記錄各組大鼠行為學(xué)評分。第23天處死動(dòng)物收集脊髓組織。(2)取腰骶部脊髓組織制成石蠟組織切片,采用免疫組化染色觀察白質(zhì)區(qū)域少突膠質(zhì)細(xì)胞丟失、神經(jīng)軸索損傷和炎性細(xì)胞浸潤情況。對早期分化階段少突膠質(zhì)細(xì)胞(NG2)、中晚期分化階段少突膠質(zhì)細(xì)胞(CC-1)和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞(MBP)進(jìn)行免疫組化染色觀察髓鞘細(xì)胞丟失情況;對神經(jīng)軸索進(jìn)行神經(jīng)絲蛋白NF200和β-淀粉樣前體蛋白APP染色觀察神經(jīng)軸索損傷情況;對T淋巴細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞分別進(jìn)行CD3、GFAP、MPO、CD68/Iba-1免疫組化染色觀察它們在脊髓中的浸潤情況。雙重免疫熒光標(biāo)記CD68和Kv1.3檢測各組大鼠脊髓組織中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞Kv1.3通道的表達(dá)。(3)對各組大鼠脊髓組織進(jìn)行LFB染色,觀察脊髓白質(zhì)脫髓鞘程度;透射電鏡超微結(jié)構(gòu)分析各組大鼠脊髓白質(zhì)中的髓鞘和神經(jīng)軸索結(jié)構(gòu)。(4)通過ELISA方法檢測各組大鼠脊髓組織勻漿中促炎細(xì)胞因子(IL-2、IFN-y、TNF-α和IL-6)的含量。采用LPS、LPS+不同濃度ImKTx88處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞,ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-6的含量。(5)采用LPS、LPS+不同濃度的ImKTx88分別處理BV2小膠質(zhì)細(xì)胞,取細(xì)胞培養(yǎng)上清分別與原代純化培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元孵育24 h,CCK8檢測少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的生存以及TUNEL染色檢測少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的凋亡情況。(6)qPCR、Wetern blot和免疫細(xì)胞熒光檢測對照組、LPS組和LPS+不同濃度ImKTx88組中BV2小膠質(zhì)細(xì)胞Kv1.3通道的表達(dá)。Western blot檢測各組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中信號通路關(guān)鍵分子MyD88、TRAF6和p65蛋白的表達(dá)。結(jié)果:(1)對照組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中無發(fā)病癥狀,EAE組大鼠從第一次免疫后第12天開始出現(xiàn)肢體癱瘓癥狀,且進(jìn)行性加重,而ImKTx88治療顯著緩解EAE大鼠發(fā)病癥狀,降低行為學(xué)評分。(2)免疫組化標(biāo)記不同分化階段的少突膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)果顯示:EAE組中,NG2、CC-1和MBP陽性細(xì)胞數(shù)量較對照組顯著降低,而ImKTx88治療組中,上述陽性細(xì)胞數(shù)量較EAE組均明顯增加。(3)免疫組化標(biāo)記神經(jīng)軸索和電鏡超微結(jié)構(gòu)分析神經(jīng)纖維結(jié)果顯示:EAE組NF200的表達(dá)較對照組明顯降低,β-APP在病灶區(qū)表達(dá)顯著提高。ImKTx88治療組NF200的表達(dá)明顯提高,β-APP在病灶區(qū)的表達(dá)顯著降低。電鏡觀察神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)顯示,EAE組中神經(jīng)軸索密度、髓鞘厚度顯著降低,而G-ratio值顯著升高。ImKTx88治療組中神經(jīng)軸索密度、髓鞘厚度明顯增加,G-ratio值顯著降低。結(jié)果提示,ImKTx88減少EAE大鼠髓鞘細(xì)胞和神經(jīng)軸索的丟失與破壞。(4)免疫組化標(biāo)記脊髓中的炎性細(xì)胞和ELISA檢測促炎細(xì)胞因子含量的結(jié)果顯示:EAE組中浸潤的CD3、GFAP、MPO和CD68/Iba-1陽性細(xì)胞的數(shù)量與對照組相比顯著增加,而ImKTx88治療組與EAE組相比,上述炎性細(xì)胞數(shù)量明顯降低。ELISA結(jié)果顯示:EAE組大鼠脊髓中促炎細(xì)胞炎性因子IL-6、TNF-α、IL-2和IFN-γ的含量與對照組相比顯著升高,而ImKTx88治療組與EAE組相比,上述促炎細(xì)胞因子的含量明顯降低。結(jié)果提示,ImKTx88能夠抑制EAE大鼠的CNS炎性反應(yīng)。(5)雙重免疫熒光標(biāo)記顯示:EAE組脊髓中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞Kv1.3通道表達(dá)明顯升高,而ImKTx88治療組中小膠質(zhì)細(xì)胞的Kv1.3通道表達(dá)顯著降低。在細(xì)胞學(xué)水平上,LPS激活的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中Kv1.3的表達(dá)顯著升高,給予ImKTx88處理后,Kv1.3通道的表達(dá)明顯降低。此外,ELISA檢測BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清促炎細(xì)胞因子的結(jié)果顯示:不同濃度的ImKTx88處理由LPS激活的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞24 h后,BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6和TNF-α的水平明顯降低。qPCR結(jié)果表明,ImKTx88抑制活化的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞IL-6和TNF-α的轉(zhuǎn)錄。同時(shí),CCK8和TUNEL染色的結(jié)果表明,ImKTx88抑制炎性上清損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元產(chǎn)生的凋亡。(6)Western blot檢測BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中信號通路蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示:LPS組與對照組相比,MyD88、TRAF6和p-p65蛋白表達(dá)顯著升高,而LPS+ImKTx88組與LPS組相比,上述蛋白的表達(dá)明顯降低。結(jié)果提示,ImKTx88可能通過阻斷MyD88/TRAF/NF-κB信號通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)Kv1.3通道阻斷劑ImKTx88能夠緩解EAE大鼠發(fā)病癥狀,抑制炎性反應(yīng),減輕髓鞘丟失和神經(jīng)軸索損傷。研究進(jìn)一步證實(shí),ImKTx88通過抑制Kv1.3通道降低BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,減輕BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎性活化導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷,其作用機(jī)制可能是通過下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞中的MyD88/TRAF6/NF-κB信號通路抑制其炎性活化。以上研究提示Kv1.3通道阻斷劑ImKTx88對于MS的臨床治療具有潛在的應(yīng)用前景。
【圖文】：

而ＩｍＫＴｘ８８治療組評分均值為１．２５分，與ＥＡＥ組相比顯著降低（Ｐ＜０．０５邋）。逡逑隨后，我們通過ＮＧ２、ＣＣ－１和ＭＢＰ免疫組化染色觀察脊髓白質(zhì)區(qū)域各分化階逡逑段的少突膠質(zhì)細(xì)胞（圖１．Ｂ－Ｄ）。結(jié)果顯示，ＥＡＥ組大鼠ＮＧ２、ＣＣ－１陽性細(xì)胞較逡逑對照組相比顯著減少（尸＜０．０１）；對照組大鼠ＭＢＰ染色顯示無脫髓鞘。ＩｍＫＴｘ８８逡逑治療組血管周圍ＮＧ２陽性細(xì)胞、ＣＣ－１陽性細(xì)胞和ＭＢＰ陽性面積和ＥＡＥ組相比逡逑明顯增加（Ｐ＜０．０５）。以上結(jié)果表明，ＩｍＫＴｘ８８治療能夠顯著降低ＥＡＥ大鼠脊髓逡逑脫髓鞘程度和髓鞘細(xì)胞的丟失，從而起到髓鞘保護(hù)作用。逡逑１７逡逑

和ＡＰＰ免疫組化染色。在對照組中，白質(zhì)區(qū)域軸索成規(guī)則排列，，ＮＦ２００陽性信逡逑號分布均勻，而在ＥＡＥ組中，白質(zhì)嚴(yán)重?fù)p傷區(qū)域ＮＦ２００著色較淺或缺失表達(dá)。逡逑ＩｍＫＴｘ８８治療組中可見軸索損傷的范圍和程度明顯減輕（圖２Ａ）。通過對各組逡逑ＮＦ２００表達(dá)進(jìn)行平均光密度（ｍｅａｎ邋ｏｐｔｉｃａｌ邋ｄｅｎｓｉｔｙ，邋ＭＯＤ）分析發(fā)現(xiàn)，ＩｍＫＴｘ８８逡逑治療組較ＥＡＥ組ＮＦ２００邋ＭＯＤ值顯著提高（尸＜０．０１邋）。對照組中ＡＰＰ呈陰性表達(dá)，逡逑ＥＡＥ組脫髓鞘病灶中，ＡＰＰ大量表達(dá)（圖２Ｂ），而ＩｍＫＴｘ８８治療組較ＥＡＥ組逡逑ＡＰＰ表達(dá)顯著降低（Ｐ０．００１）。逡逑１８逡逑
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R744.51

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