【摘要】：癲癇(epilepsy)是一種慢性腦部疾病,它嚴(yán)重危害人類的健康,發(fā)病率在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中僅次于腦血管疾病。我國約有900萬人受其危害,且約30%被診斷為難治性癲癇。其中,顳葉癲癇(temporal lobe epilepsy,TLE)在該類型中最常見,而氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠模型可以很好地模擬研究人類顳葉癲癇。Salubrinal,在國內(nèi)有許多學(xué)者認(rèn)為其可能是一種有很好的神經(jīng)保護作用的藥物,可以選擇性抑制elf2α去磷酸化。在細(xì)胞應(yīng)激狀況下,elf2α磷酸化狀態(tài)可以使細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境保持相對穩(wěn)定。此外,elf2α磷酸化可使胞內(nèi)蛋白合成減少,也可使ATF4的表達(dá)增加。目前來說細(xì)胞凋亡可能主要有三條信號通路:1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑;2、線粒體途徑以;3、死亡受體途徑。Boycott等[1]研究發(fā)現(xiàn),salubrinal是可以有效抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡,但是具體機制目前還不是很清楚。Parkin,它是E3泛素連接酶,在線粒體自噬和凋亡過程中扮演十分重要的作用[2,3],Parkin的主要功能主要是通過介導(dǎo)底物蛋白泛素化來調(diào)控蛋白的降解以及信號通路。研究表明,在許多應(yīng)激下,Parkin具有保護細(xì)胞、抑制細(xì)胞死亡的作用[4,5,6]。但是目前為止,Salubrinal在神經(jīng)元凋亡中的作用還不是很清楚,是否能減輕氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡也不確定。本課題把氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠模型作為本次研究的對象,把Salubrinal作為該模型的干預(yù)劑,觀察癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元的凋亡情況,并探究Salubrinal的磷酸化水平及Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬水平,最后明確癲癇大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡及Salubrinal對凋亡的保護作用,并探討其機制。本研究分二個部分:第一部分Salubrinal對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的保護作用及機制研究目的研究癲癇大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡及Salubrinal對凋亡的保護作用,并探討其機制。方法60只成年雄性并且健康的wistar大鼠隨機分為對照組、PILO組(氯化鋰-匹魯卡品誘導(dǎo)的大鼠癲癇模型)、Salubrinal(Sal)+PILO組及Sal組。TUNEL和免疫組化觀察對照組和處理組癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)后24h海馬神經(jīng)元的凋亡。Western blot實驗分析海馬elf2α、P-elf2α、Parkin及LC3的表達(dá)情況。結(jié)果1、PILO組與對照組相比海馬神經(jīng)元存在明顯的凋亡。2、較PILO組而言,Sal+PILO組海馬神經(jīng)元凋亡明顯減輕。3、Sal+PILO組與PILO組相比,海馬神經(jīng)元P-elf2α表達(dá)量增高(P0.05),而elf2α表達(dá)無明顯變化;LC3II的表達(dá)量及Parkin顯著增高(P0.05)。結(jié)論1、氯化鋰-匹魯卡品誘導(dǎo)的癲癇大鼠存在海馬神經(jīng)元凋亡。2、Salubrinal能夠減輕癲癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡,其機制可能是Salubrinal通過elf2α磷酸化上調(diào)parkin表達(dá)、增加自噬水平,進而有效減少癲癇大鼠海馬神經(jīng)元調(diào)亡。第二部分Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的保護作用目的明確Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬對癲癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的保護作用。方法用Parkin過表達(dá)重組腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠海馬CA1區(qū)7天后,腹腔注射氯化鋰-匹魯卡品誘導(dǎo)大鼠顳葉癲癇模型。將60只健康雄性wistar大鼠隨機分為4組,野生型對照組(Ctr組);匹魯卡品癲癇組(PI組);匹魯卡品+Parkin過表達(dá)腺病毒組(PIPO組)以及Parkin過表達(dá)腺病毒組+生理鹽水(PO組)。觀察和比較Ctr組和處理組癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)后24h海馬CA1區(qū)凋亡的變化。Western blot分析和比較各組海馬Parkin及LC3的蛋白表達(dá)情況。透射電鏡下觀察和比較各組大鼠海馬自噬小體和凋亡小體的數(shù)量。結(jié)果1、與Ctr組相比,PI組海馬CA1區(qū)凋亡數(shù)量明顯增多,而PIPO組海馬凋亡數(shù)量較PI組明顯減少(P0.05)。2、與Ctr組相比,透射電鏡下PI組海馬神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)明顯破壞,自噬小體和凋亡小體數(shù)量明顯增多;與PI組相比,PIPO組海馬神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)破壞減輕,自噬小體數(shù)量明顯增加,但凋亡小體數(shù)量明顯減少。3、Western blot實驗分析顯示,與Ctr組相比,PI組Parkin表達(dá)水平降低,LC3II/LC3I比值升高(P0.05)。與PI組比較,PIPO組Parkin和LC3II/LC3I比值均明顯升高(P0.05)結(jié)論1、氯化鋰-匹魯卡品誘導(dǎo)的癲癇大鼠海馬Parkin表達(dá)水平下降,伴隨明顯的凋亡及線粒體損傷。2、Parkin過表達(dá)可減輕癲癇大鼠的凋亡和線粒體損傷,Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬對氯化鋰-匹魯卡品癲癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡具有保護作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R742.1

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本文編號：2583568