【摘要】：目的構(gòu)建含大鼠ASIC2a全長互補脫氧核糖核酸(cDNA)的綠色熒光蛋白真核表達質(zhì)粒pEGFPN1-ASIC2a并轉(zhuǎn)染至HEK293細胞,觀察其表達和分布情況。方法設計、合成ASIC2a基因引物,利用聚合酶鏈反應(PCR)技術,以現(xiàn)有質(zhì)粒pc DNA3.1-ASIC2a為模板擴增出含有限制性內(nèi)切酶(XhoⅠ與EcoRⅠ)酶切位點的ASIC2a基因片段與載體pEGFP-N1酶切后連接形成重組質(zhì)粒pEGFP-N1-ASIC2a,并瞬時轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中,利用細胞膜片鉗方法觀察其表達電流的情況。為進一步明確其亞細胞定位,將質(zhì)粒EGFPN1-ASIC2a、pDs Red-Monomer-Mem和pDs Red2-ER共同轉(zhuǎn)染至HEK293細胞中。結(jié)果 PCR擴增得到正確的ASIC2a基因片段,酶切鑒定和測序證實獲得重組質(zhì)粒pEGFP-N1-ASIC2a,并將其瞬轉(zhuǎn)至HEK293細胞后,成功記錄到ASIC2a同聚體電流。然后利用共轉(zhuǎn)染的方法觀察到,pEGFP-N1-ASIC2a主要在HEK293細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表達,細胞膜表達較少。結(jié)論重組綠色熒光蛋白真核表達載體pEGFP-N1-ASIC2a構(gòu)建成功,且在HEK293細胞中主要表達于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),為下一步研究ASIC2a的功能,特別是為ASIC2a在缺血性神經(jīng)元損傷中的作用及其機制的研究奠定基礎。

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