【摘要】：目的:研究不同來源的空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni，Cj）經(jīng)過連續(xù)多批小鼠灌胃消化道排出后，與原代空腸彎曲菌相比，其各分離變異株間生長繁殖能力、革蘭染色形態(tài)變化等毒力的不同；同時進(jìn)一步觀察分析空腸彎曲菌分離變異株間致周圍神經(jīng)病變能力的差異，為了解認(rèn)識在消化道環(huán)境中空腸彎曲菌毒力改變及不同毒力的空腸彎曲菌致周圍神經(jīng)病變能力的差異奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.復(fù)蘇培養(yǎng)原代空腸彎曲菌：選擇河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科實驗室-80℃冰箱中凍存的，分離自急性運動性軸索型（AMAN型）吉蘭-巴雷綜合征（Guillain-Barre syndrome, GBS）患者糞便中的空腸彎曲菌lulei株和分離自單純細(xì)菌性腹瀉患者糞便中的空腸彎曲菌NCTC11168株。將它們于室溫溶化后，取500ul菌液倒入乘有5ml滅菌布氏肉湯培養(yǎng)基的潔凈西林瓶中，置于三氣培養(yǎng)箱中，在42℃微需氧（10%CO2、5%O2、85%N2）環(huán)境下增菌24小時，后傳代至含7%脫纖維羊血的哥倫比亞血平板培養(yǎng)基上，于相同環(huán)境條件下培養(yǎng)24小時，以同樣方法傳代至第3代，成功復(fù)蘇空腸彎曲菌。 2.空腸彎曲菌的鑒定：采用革蘭染色和馬尿酸鈉水解試驗的方法鑒定空腸彎曲菌。 3.實驗動物的選擇和分組方法：選用4周齡，體重18-20g，雄性清潔級健康昆明小鼠。共分為9個批次，每一批次3組，分別為lulei株組、NCTC11168株組和布氏肉湯對照組，每一組2只小鼠，共54只小鼠。 4.給菌方法和濃度：實驗組小鼠經(jīng)口灌胃3×108cfu/ml濃度的活菌菌懸液0.5ml；對照組小鼠灌胃滅菌布氏肉湯0.5ml，所有小鼠灌喂前均禁食水12小時，灌胃后立即給予食水。 5.空腸彎曲菌分離培養(yǎng):將原代空腸彎曲菌lulei株和NCTC11168株灌胃第一批次小鼠，共灌胃2次，間隔24小時，分別于灌胃后48小時和72小時采集小鼠糞便，并從糞便中分離純化上述2個時間點的空腸彎曲菌分離變異株。將分離純化得到的72小時空腸彎曲菌lulei分離變異株和NCTC11168分離變異株分別灌胃第二批次小鼠，以此類推，直至完成9個批次空腸彎曲菌的分離培養(yǎng)。 6.不同批次相同時間點，空腸彎曲菌分離變異株間生長繁殖能力及革蘭染色形態(tài)變化觀察：細(xì)菌的生長繁殖能力是評價細(xì)菌毒力的重要指標(biāo)，分別采用平板菌落計數(shù)法和革蘭染色的方法比較各空腸彎曲菌分離變異株間生長繁殖能力及革蘭染色形態(tài)變化的差異。 7.實驗動物一般情況的觀察：自灌胃當(dāng)日起每天觀察小鼠的狀態(tài)：如進(jìn)食水情況、精神狀態(tài)、大便性狀、皮毛光滑程度、體重及肢體活動情況等，一般觀察時間為30天，之后處死解剖動物，取雙側(cè)坐骨神經(jīng)進(jìn)行神經(jīng)病理觀察，如動物在30天內(nèi)出現(xiàn)明顯癱瘓癥狀，隨時解剖取材病理觀察。 8.不同批次小鼠周圍神經(jīng)病理學(xué)檢查：采用HE染色、免疫組織化學(xué)染色、鋨酸染色、甲苯胺藍(lán)染色和透射電子顯微鏡的方法觀察不同批次小鼠周圍神經(jīng)病理變化。 結(jié)果： 1.不同批次空腸彎曲菌分離變異株間單位時間內(nèi)生長繁殖速度不同，各批次相同采集糞便的時間點分離得到的變異株，隨著批次的增加空腸彎曲菌生長繁殖能力逐漸增強(qiáng)，且呈現(xiàn)出非線性增強(qiáng)的趨勢。 2.不同批次空腸彎曲菌分離變異株間革蘭染色鏡檢觀察，形態(tài)發(fā)生變化。隨著批次增加，空腸彎曲菌lulei分離變異株菌體逐漸變長、變細(xì)，螺旋桿狀或彎曲桿狀程度逐漸明顯，呈雙“S”形或三“S”形；空腸彎曲菌NCTC11168分離變異株間菌體逐漸變短，存在由“直桿狀”向“C”形變化的趨勢。 3.小鼠一般情況的觀察：第7批次lulei組1只小鼠于灌胃后72小時出現(xiàn)明顯雙側(cè)后肢完全癱瘓癥狀，完全依靠前肢拖拽活動，活動能力差，進(jìn)食水少，，精神狀態(tài)不佳，毛豎起，體重?zé)o明顯減輕，大便性狀無明顯改變，余實驗組和對照組小鼠在灌胃后30天解剖時活動能力及進(jìn)食水情況如常，精神狀態(tài)好，體重?zé)o明顯減輕。 4.小鼠周圍神經(jīng)病理學(xué)觀察：第7批次lulei組1只癱瘓小鼠坐骨神經(jīng)出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變，表現(xiàn)為：HE染色可見軸索粗細(xì)不均，表面不光滑，部分?jǐn)嗔�。免疫組織化學(xué)染色可見髓鞘斷裂消失；軸索粗細(xì)不均、斷裂。鋨酸染色可見脫髓鞘表現(xiàn)，神經(jīng)髓鞘回縮，呈“城墻樣”改變，在郎飛氏節(jié)附近髓鞘回縮明顯；同時在郎飛氏節(jié)附近可見髓鞘再生。甲苯胺藍(lán)染色可見髓鞘脫落、斷裂，部分髓鞘向軸索方向脫落壓迫軸索，同時可見髓鞘再生，軸索出現(xiàn)華勒樣變性。透射電子顯微鏡觀察，可見線粒體脊消失，線粒體外膜腫脹；軸索膜與髓鞘膜分離，髓鞘板層結(jié)構(gòu)消失，呈同心圓樣向軸索方向回縮，壓迫軸索。余實驗組及對照組小鼠在灌胃30天后解剖取坐骨神經(jīng)，采用上述方法觀察病理學(xué)改變，表現(xiàn)為髓鞘及軸索光滑完整，未見神經(jīng)病理學(xué)變化。 結(jié)論： 1.不同來源的空腸彎曲菌lulei株和NCTC11168株經(jīng)連續(xù)多批次小鼠灌胃消化道分離后，相同采集糞便時間點得到的變異株間生長繁殖能力隨著批次增加逐漸增強(qiáng)，且增強(qiáng)趨勢為非線性�？漳c彎曲菌分離變異株間革蘭染色鏡檢細(xì)菌形態(tài)出現(xiàn)連續(xù)性變化。說明空腸彎曲菌在經(jīng)過小鼠消化道排出體外后毒力增強(qiáng)，且這種增強(qiáng)趨勢為非線性，空腸彎曲菌的形態(tài)在消化道環(huán)境影響下發(fā)生連續(xù)改變。 2.不同毒力的空腸彎曲菌連續(xù)2次小鼠灌胃后，未出現(xiàn)明顯腹瀉癥狀，但可以出現(xiàn)類似吉蘭-巴雷綜合征的癱瘓癥狀和周圍神經(jīng)病理改變。說明空腸彎曲菌在消化道環(huán)境中毒力增強(qiáng)不足以導(dǎo)致小鼠腹瀉癥狀的發(fā)生。雖然空腸彎曲菌與吉蘭-巴雷綜合癥間關(guān)系密切，然而，伴隨空腸彎曲菌毒力增強(qiáng)，其導(dǎo)致小鼠癱瘓癥狀及周圍神經(jīng)病理改變的能力未出現(xiàn)同步加強(qiáng)，說明擬通過使用經(jīng)小鼠消化道后毒力加強(qiáng)的空腸彎曲菌2次口服灌胃實驗小鼠的方法，不能達(dá)到建立穩(wěn)定的類似吉蘭-巴雷綜合征臨床和周圍神經(jīng)病變動物模型的能力。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R745.4

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 宋爽;GBS相關(guān)C.jejuni感染昆明小鼠消化道研究及老年急性缺血性腦卒中疾病分型[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

本文編號：2583301