【摘要】：目的:應(yīng)用基因沉默技術(shù)手段,觀察下調(diào)PSMB5對NSCs增殖潛能的影響,揭示年齡依賴性NSCs增殖能力降低的機制,以期為神經(jīng)退行性疾病的治療提供新思路。方法:1.體外分離培養(yǎng)胚胎(E14)、新生(P0)、幼年(P30)、成年(P90)和老年(P540)小鼠SVZ NSCs,觀察其神經(jīng)球形成周期和神經(jīng)球形成率。2.分別提取不同年齡階段(E14、P0、P30、P90、P540)Balb/c小鼠SVZ組織蛋白,通過Western Blot分析其PSMB5蛋白的表達水平差異。3.設(shè)計合成PSMB5-si RNA,電穿孔法轉(zhuǎn)染NSCs,電轉(zhuǎn)后48h提取細胞總RNA,72h提取細胞全蛋白,RT-PCR及Western Blot分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平測定PSMB5沉默效率,熒光分光光度法檢測蛋白酶體活性。4.測量神經(jīng)球平均直徑和數(shù)量,并應(yīng)用Brd U摻入實驗分析PSMB5基因沉默對NSCs增殖能力的影響,5.Western Blot檢測細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1及CDK4的表達變化。結(jié)果:1.分離培養(yǎng)的不同年齡階段小鼠NSCs,其中與E14或P0相比,P30、P90及P540小鼠NSCs形成神經(jīng)球的周期較長,神經(jīng)球形成率較低,提示NSCs增殖能力呈年齡依賴性下降趨勢;同時,Western Blot檢測各年齡組SVZ組織蛋白顯示PSMB5的表達水平隨年齡增高也呈遞減趨勢,提示PSMB5可能參與NSCs增殖能力的調(diào)控。2.Real-time PCR定量分析法和Western Blot半定量分析法分別檢測si RNA組和對照組PSMB5 m RNA及PSMB5蛋白的表達變化,結(jié)果顯示si RNA組PSMB5m RNA和蛋白表達水平較對照組分別降低61.23±1.62%和40.11±2.45%(P0.05),且蛋白酶體活性較對照組降低24.36±0.14%(P0.01),提示PSMB5-si RNA電轉(zhuǎn)染NSCs能夠抑制其PSMB5的表達,并下調(diào)蛋白酶體活性。3.si RNA組神經(jīng)球平均直徑和數(shù)量均較對照組顯著降低(P0.05);Brd U摻入實驗結(jié)果顯示si RNA組Brd U陽性率21.58±3.29%較對照組53.47±7.36%顯著下降(P0.05),提示PSMB5基因沉默能抑制NSCs增殖能力。4.應(yīng)用Western Blot半定量分析轉(zhuǎn)染后細胞周期相關(guān)蛋白的表達水平,結(jié)果顯示si RNA組細胞周期依賴性蛋白Cyclin-D1及其激酶CDK4的表達水平分別較對照組下降46.82±3.14%和32.86±2.75%(P0.05),提示PSMB5基因沉默可能通過下調(diào)細胞周期依賴性蛋白Cyclin D1及其激酶CDK4的表達水平,從而影響NSCs增殖潛能。結(jié)論:1.PSMB5可能參與NSCs增殖潛能的調(diào)控。2.PSMB5基因沉默能夠通過降低蛋白酶體活性,下調(diào)細胞周期依賴性蛋白Cyclin-D1及其激酶CDK4的表達,從而抑制NSCs增殖潛能。
【圖文】：

2.1 SVZ NSCs 增殖潛能呈現(xiàn)年齡依賴性下降趨勢NSCs 原代初接種培養(yǎng)時細胞呈圓形，體積較小，胞體透明，，折光性強。之后，圓形細胞體積逐漸增大，個別細胞開始分裂呈啞鈴形；數(shù)天后培養(yǎng)瓶中開始出現(xiàn)一些小神經(jīng)球，神經(jīng)球由 5-8 個圓形細胞緊密聚集而成，球體中心部比較膨隆有立體感（圖 1-1）。將不同年齡階段 NSCs 按照 1 ×105/mL 的密度接種于 6 孔培養(yǎng)板，觀察不同年齡階段 NSCs 形成神經(jīng)球（約 120μm）所需時間(圖 1-2)，神經(jīng)球達到 120μm時 E14 組和 P0 組約需 3-4d，P30 組需要 5-7d，P90 組需要 8-10d，而 P540 組時間比較長需要 12-14d，且形成神經(jīng)球的數(shù)目呈遞減趨勢(圖 1-3)。提示隨著年齡增加，NSCs 形成神經(jīng)球的周期逐漸延長，NSCs 的增殖能力下降，NSCs 的增殖能力隨年齡呈遞減趨勢，表現(xiàn)在神經(jīng)球形成周期和神經(jīng)球數(shù)目的差異。

2.2 SVZ PSMB5 蛋白的表達水平呈現(xiàn)年齡依賴性下降趨勢提取各年齡階段小鼠 SVZ 組織蛋白，通過 Western Blot 方法檢測 PSMB5 蛋白的表達水平，實驗結(jié)果顯示 E14 和 P0 小鼠 SVZ PSMB5 的表達明顯高于 P30，P9P540，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。P540 小鼠 SVZ PSMB5 的表達顯著降低，與其他組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。P30、P90 的表達介于 E14 和 P540 之間且兩組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05) (圖 2-1)，表明 PSMB5 的表達隨年齡增高也呈遞減趨勢，提示 PSMB5 可能參與 NSCs 增殖潛能的調(diào)控。5圖 1-2 不同年齡階段 NSCs 形成神經(jīng)球所需時間（*P<0.05 vs E14）圖 1-3 不同年齡階段 NSCs 形成各直徑范神經(jīng)球數(shù)目（*P<0.05 vs E14）20-60μm 60-80μm 80-100μmE14 P0 P30 P90 P540
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R741

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 譚雪鋒,金國華,田美玲,秦建兵,徐慧君;白介素-1α及與白介素-11、白血病抑制因子和膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)生長因子聯(lián)合誘導人神經(jīng)干細胞向多巴胺神經(jīng)元的分化[J];解剖學報;2005年04期

2 陳小波;程飚;劉宏偉;孫同柱;付小兵;;雌激素對人表皮干細胞增殖與遷移影響的體外實驗[J];中國修復重建外科雜志;2011年02期

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 邢雪松;局灶性腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖分化的機制及bFGF的干預(yù)[D];中國醫(yī)科大學;2008年

本文編號：2570924