【摘要】：研究背景： 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最致命的疾病之一,大多數(shù)GBM患者的生存期是12個(gè)月。目前針對(duì)GBM的治療方法有手術(shù)、化療和放療等。然而,多數(shù)GBM患者的生存時(shí)間只增加了3個(gè)月。影響其徹底治愈的因素有腫瘤的手術(shù)后復(fù)發(fā),腫瘤對(duì)周圍正常組織的浸潤(rùn),以及固有或獲得性放化療耐藥性的產(chǎn)生。 雖然針對(duì)DNA-甲基化的藥物制劑替莫唑胺(TMZ)已經(jīng)用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療,多個(gè)生長(zhǎng)因子受體如PDGFR、表皮生長(zhǎng)因子受體已經(jīng)作為治療靶點(diǎn)。在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中加入PDGFR/c-KIT abl激酶抑制劑顯著降低了細(xì)胞的活性和非貼壁生長(zhǎng)的趨勢(shì)。但臨床上只有10-20%的患者對(duì)這些抑制劑產(chǎn)生治療效果。由于耐藥性的產(chǎn)生,大多數(shù)病人隨后表現(xiàn)出腫瘤快速生長(zhǎng)。威爾遜等人發(fā)現(xiàn)RTK配體的抑制劑可以逆轉(zhuǎn)腫瘤的固有耐藥和獲得性耐藥。然而其具體的作用機(jī)制尚未完全闡明。 伊馬替尼是最具代表性的RTK抑制劑。在體內(nèi)外的神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中已經(jīng)證實(shí)伊馬替尼可抑制腫瘤生長(zhǎng)。我們前期試驗(yàn)中構(gòu)建了耐伊馬替尼的GBM細(xì)胞株U251AR,通過二維差異凝膠電泳法(2D-DIGE)和蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析法研究與GBM化療耐藥性相關(guān)的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)在研究蛋白質(zhì)特性方面有著極為重要的作用。2D-DIGE對(duì)蛋白分離和量化相當(dāng)敏感。蛋白質(zhì)通過與不同的熒光染料標(biāo)記后混合,通過凝膠分離。蛋白質(zhì)組學(xué)方法為我們探索腫瘤的多藥耐藥、尋找腫瘤生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)方面提供新的機(jī)遇。 聚合酶Ⅰ和轉(zhuǎn)錄釋放因子(PTRF),最早稱為cavinl,在體外培養(yǎng)細(xì)胞中參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的解離。PTRF存在于細(xì)胞膜表面,與胞膜小泡轉(zhuǎn)運(yùn),膽固醇平衡和脂類分解的調(diào)控有關(guān)。PTRF突變與人類先天性全身性脂肪代謝障礙有關(guān)�；蛳嗷プ饔醚芯勘砻�,PTRF除有上述功能外,還可能有其他功能。在前列腺癌和肺癌中,PTRF表達(dá)的缺失被認(rèn)為與腫瘤增殖有關(guān)。PTRF的胞質(zhì)微囊結(jié)構(gòu)蛋白和caveolinl在乳腺癌的化療多藥耐藥中有著至關(guān)重要的作用。PTRF可誘發(fā)多種體外培養(yǎng)細(xì)胞及斑馬魚胚胎細(xì)胞中形成豐富的胞質(zhì)微囊。PTRF和caveolinl在細(xì)胞質(zhì)微囊中有著密切聯(lián)系。已有報(bào)道表明caveolin蛋白位于胞質(zhì)微囊,其對(duì)微囊本身有著至關(guān)重要的作用。Quann和他的同事發(fā)現(xiàn),在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U87中過表達(dá)caveolinl可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和生存。與正常腦組織中的星形細(xì)胞相比,caveolinl在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的表達(dá)量明顯增多。在人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤體內(nèi)外模型中,瘤細(xì)胞耐受TMZ后影響了caveolinl的表達(dá)。然而,PTRF在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的相關(guān)研究卻很少。因此,在本實(shí)驗(yàn)中,我們研究PTRF在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株及臨床標(biāo)本中的表達(dá)和相關(guān)功能。并分析PTRF在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞耐藥性中的作用。我們的數(shù)據(jù)表明PTRF可成為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者治療的新靶點(diǎn),對(duì)膠質(zhì)瘤的治療可能具有重大意義。目的： 本研究通過構(gòu)建膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U251的化療耐藥細(xì)胞株U251AR,并通過熒光標(biāo)記的雙向電泳技術(shù)及蛋白質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定U251及U251AR差異表達(dá)的蛋白；通過western blot及QRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白PTRF在各細(xì)胞株中的表達(dá)。并構(gòu)建干擾質(zhì)粒敲除PTRF在U251及U251AR中的表達(dá),MTT及細(xì)胞耐藥性進(jìn)一步證實(shí)PTRF在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤化療耐藥性中的作用。同時(shí),我們研究PTRF的協(xié)同蛋白caveolinl在U251AR細(xì)胞系中表達(dá)。最后,我們免疫組化及QRT-PCR技術(shù)在原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及常規(guī)化療后復(fù)發(fā)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的組織標(biāo)本中的表達(dá),我們通過相關(guān)性分析PTRF及caveolin1在所有膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中的相關(guān)情況。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、組織標(biāo)本的收集 病人標(biāo)本收集于珠江醫(yī)院和南方醫(yī)院(南方醫(yī)科大學(xué)、廣州、中國(guó))。研究對(duì)象包括Ⅰ級(jí)星形細(xì)胞瘤8例,Ⅱ級(jí)星形細(xì)胞瘤13例,Ⅲ級(jí)星形細(xì)胞瘤10例,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤27例。在27個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤表本中,6例在接受TMZ治療6個(gè)月后復(fù)發(fā)。在標(biāo)本收集之前,根據(jù)南方醫(yī)科大學(xué)倫理學(xué)機(jī)構(gòu)的指導(dǎo)方針,所有患者給予書面告知并取得知情同意。在手術(shù)室手術(shù)切除組織樣本后立即快速冰凍。腫瘤及非腫瘤組織由神經(jīng)病理學(xué)教授診斷鑒定。正常組織鑒定標(biāo)準(zhǔn)為：根據(jù)病檢證實(shí)未發(fā)現(xiàn)有腫瘤細(xì)胞。對(duì)于每一個(gè)病人,留取腫瘤組織樣本(存儲(chǔ)在-80攝氏度冰箱)和石蠟包埋組織標(biāo)本。 2、細(xì)胞培養(yǎng)及耐藥細(xì)胞株的構(gòu)建 人類GBM細(xì)胞株U251由南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院饋贈(zèng)。多藥耐藥細(xì)胞株U251AR由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并培養(yǎng)。細(xì)胞株使用DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)(含10%胎牛血清FBS,青霉素200U/毫升和鏈霉素100μg/毫升)。細(xì)胞在37℃,5%的二氧化碳,濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。通過對(duì)U251細(xì)胞株不斷增加伊馬替尼(STI571)的濃度,本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建具有伊馬替尼耐藥的細(xì)胞系U251AR.為保持U251AR細(xì)胞多藥耐藥性,在U251AR細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加伊馬替尼(濃度122μg/毫升)。 3、細(xì)胞免疫熒光 調(diào)整細(xì)胞密度為3×105細(xì)胞/孔,置于Lab-Tek雙孔載玻片并孵育過夜.隔日,當(dāng)細(xì)胞鋪滿50-70%,PBS清洗兩次后用4%多聚甲醛固定和0.1％Tritonx-100,4攝氏度下滲透30分鐘。然后PBS清洗細(xì)胞3次并用封閉液孵育。成功后加入PTRF或caveolinl一抗,4攝氏度下過夜。之后PBS清洗3次,加入二次抗體山羊抗兔Alexa Fluor488(1:1,000)室溫下暗室靜置1h。最后,PBS清洗3次,加入0.25毫克／毫升DAPI室溫下暗室靜置1分鐘。PBS足量清洗,恒定曝光條件下,使用激光共聚焦掃描顯微鏡60倍下觀察。 4、U251及U251AR細(xì)胞的蛋白提取 從U251和U251AR細(xì)胞株細(xì)胞提取細(xì)胞裂解液。加入冰凍裂解緩沖液和裂解混合液,機(jī)械破壞細(xì)胞。樣本經(jīng)超聲處理(冰浴,每次10秒,30秒后重復(fù)6次)和離心(15000g,30分鐘,4攝氏度)。超速離心108000轉(zhuǎn),60分鐘,4攝氏度下提取上清液。Bradford蛋白質(zhì)分析法測(cè)定濃度和所提取蛋白質(zhì)(100μg)在-80攝氏度保存。 5、蛋白的熒光標(biāo)記 蛋白提取物按CyDyes DIGE Fluors (GE Healthcare, Bucks, UK)推薦說明書處理,使用CyDyesFluors熒光素標(biāo)記。簡(jiǎn)而言之,每50μg樣本的最少加入400pmol胺反應(yīng)類花青染料(Cy3或Cy5)暗室中冰浴30分鐘。U251和U251AR都用Cy5或Cy3不同的凝膠標(biāo)記。Cy2熒光染料標(biāo)記內(nèi)參照,將等量的U251和U251AR細(xì)胞共培養(yǎng)。黑暗中加入10mM賴氨酸,冰浴10分鐘后終止標(biāo)記反應(yīng)。標(biāo)記反應(yīng)物,U251和U251AR細(xì)胞提取物與內(nèi)參照一起,加入DestreakTMIEF緩沖液達(dá)到450μl,放入5個(gè)24厘米長(zhǎng)的凝膠片。 6、熒光雙向電泳的制備及蛋白電泳分析 使用IPGphorTM系統(tǒng)完成等電點(diǎn)電泳。預(yù)先固定pH梯度膠(pH值3-10,24厘米),用于單向分離。IEF之后,IPG條帶環(huán)境溫度下在含有65mM DTT和250mM碘乙酰胺的平衡溶液中孵2次,各15分鐘。條被直接置于預(yù)制的12%sds-page凝膠頂部并在Ettan DaltSix系統(tǒng)垂直電泳約5小時(shí)。另一個(gè)凝膠跑帶以同樣的方式選擇蛋白質(zhì)。 7、2D-DIGE凝膠成像及數(shù)據(jù)分析 在凝膠電泳后,cyanine標(biāo)記的蛋白質(zhì)在TyphoonTM9400成像儀熒光模式下直接可視。Cy2, Cy3, Cy5圖像分別用488nm,532nm和633nm激光掃描所得。每個(gè)凝膠在200μm分辨率(像素大小)下掃描,使用DeCyder處理軟件V5.01對(duì)其進(jìn)行量化、凝膠匹配和統(tǒng)計(jì)分析。為消除圖像的人為影響和圖像中蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的差異量化使用DIA對(duì)每個(gè)凝膠的兩個(gè)樣品在(U251和U251AR)予以配對(duì)比較。使用BVA,同時(shí)對(duì)比凝膠匹配圖中所有的蛋白斑點(diǎn)。使用S檢驗(yàn)(p0.05)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。標(biāo)準(zhǔn)化后,蛋白質(zhì)斑點(diǎn)至少在1.5倍以上的體積的變化被認(rèn)為調(diào)控差異。統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算結(jié)果與Engelen K. et al報(bào)道的結(jié)果基本相似。雙凝膠匹配的斑點(diǎn)以的標(biāo)準(zhǔn)偏差log10條件下計(jì)算分析。計(jì)算每個(gè)條件下標(biāo)準(zhǔn)差的中位數(shù)。2D-DIGE成像和分析后,考馬斯蘭染制備凝膠。凝膠進(jìn)行掃和存儲(chǔ)在1%醋酸,4攝氏度下完成,直到斑點(diǎn)消失。手動(dòng)匹配考馬斯蘭凝膠與熒光地圖,使用Image MasterTM2d軟件選擇分析。 8、質(zhì)譜鑒定 考馬斯藍(lán)染色的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)從雙向凝膠中切除并用EttanTM斑點(diǎn)處理工作站軟件處理。膠填充物用MilliQ水洗3次,然后用50%甲醇/50mM碳酸氫銨和75%ACN沖洗,確保完全去除染料和洗滌劑。干燥后,凝膠塊在20毫NH4HCO3和16.6μg/毫升豬胰蛋白酶再次水化60分鐘。分別連續(xù)添加50%的ACN和50%的TFA完成提取。消化產(chǎn)物脫水后,在斑點(diǎn)到達(dá)MALDI靶點(diǎn)之前,溶解在含2毫克/毫升a-cyano-4-hydroxycinnamic酸的70%ACN/0.1%TFA中。MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜計(jì)獲得肽團(tuán)塊印記,使用FlexAnalysisTM軟件生成峰值列表并用胰蛋白酶的自動(dòng)消化肽段做內(nèi)參。峰列表然后轉(zhuǎn)移至ProteinScapeTM軟件,以包含自我分解的峰值和污染物為基礎(chǔ),做為另一個(gè)自動(dòng)校準(zhǔn)列表(與樣本有類型和治療有關(guān))。再次校準(zhǔn)后,自動(dòng)胰蛋白酶和燃料進(jìn)行了過濾和刪除,得到m/z比率和高鑒別率(Score-Booster)。只有單一同位素的胰蛋白酶肽團(tuán)塊被用于使用Mascot search algorithm NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)序列檢索。搜索條件如下：初始窗口以70ppm為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn),接受只錯(cuò)過一個(gè)斷裂的團(tuán)塊,以碘乙酰胺和甲硫氨酸氧化變量調(diào)整半胱氨酸。使用probability-based Mowse獲取結(jié)果評(píng)分(蛋白質(zhì)數(shù)是-10×log(P))。P是一個(gè)隨機(jī)事件發(fā)生的概率。在我們的實(shí)驗(yàn)中,得分大于90具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 9、Western bolt 胞質(zhì)蛋白提取液(10～30μg)加入12%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行單通道電泳。使用生物素化ECL western blotting作為分子量標(biāo)記。蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移至PVDF膜,U251, U251AR和其他細(xì)胞中提取等量蛋白,由Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒計(jì)算單位體積的蛋白含量,在每個(gè)凝膠中加入等量的蛋白后進(jìn)行量化分析。非特異性位點(diǎn)被含5%(w/v)脫脂奶粉的Tris-buffered鹽水(TBS)封閉。斑點(diǎn)加入一抗后,在含有0.1%Tween20和1%脫脂奶粉的TBS中孵育。一抗主要包括：兔抗人單克隆抗體PTRF(稀釋比例1：1000),兔抗人單克隆抗體caveolinl (稀釋比例1：1500),兔抗人單克隆抗體VIM(稀釋比例1：1000)和山羊抗人單克隆抗體P-gp(稀釋比例1：150),P-actin作為內(nèi)參。TBS沖洗后,印記在過氧化物結(jié)合的IgG二抗1：5000和Streptavidin-HRP(生物素化的標(biāo)記)中孵育,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光體系ECL用于顏色顯影。 10、QRT-PCR 總RNA提取使用Trizol試劑盒完成,反轉(zhuǎn)錄使用的引物Script RT reagent Kit。熒光定量RT-PCR根據(jù)SYBR Green試劑盒說明書進(jìn)行,依據(jù)MX7500序列檢測(cè)系統(tǒng)完成。引物在表1中列出。GAPDH作為內(nèi)參。所有樣品都以內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)量化,倍數(shù)的計(jì)算通過相對(duì)量化得出(2△△CT)。 11、PTRF的干擾 BLOCK-iT Pol II miR RNAi表達(dá)載體用來誘導(dǎo)干擾PTRF。簡(jiǎn)而言之,單鏈microRNA退火形成雙列,插入至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體(Invitrogen,USA)。針對(duì)PTRF的短發(fā)卡RNA(shRNA)被稱為shPTRF。空載體為shNC。根據(jù)說明書,質(zhì)粒LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染到U251AR和U251細(xì)胞。孵化后24小時(shí),加入500ng/mL鹽酸殺稻瘟菌素。轉(zhuǎn)染后,定量RT-PC檢測(cè)PTRF的mRNA水平。隨后,分析多個(gè)低表達(dá)PTRF的mRNA,并通過Western blotting進(jìn)一步分析PTRF蛋白含量。最后,選出有效敲除PTRF的細(xì)胞株作干擾組進(jìn)行分析。細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體作為陰性對(duì)照。 12、體外耐藥性檢測(cè) U251及U251AR細(xì)胞轉(zhuǎn)染shNC和shPTRF后置于96孔板中,密度為每孔2×103個(gè)細(xì)胞,終體積為100μL。加入100μg/毫升TMZ孵化后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)和120小時(shí)后通過CCK8法分析細(xì)胞生存能力。耐藥性方面,細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24h,再次植入從96孔板,密度為1.5×104/孔,與伊馬替尼,VP-16或TMZ(50到200μg/毫升)共培養(yǎng)48h。 13、膠質(zhì)瘤患者組織標(biāo)本的免疫組化鑒定 組織中PTRF和caveolinl的表達(dá)水平,使用超靈敏S-P試劑盒,按試劑盒說明書完成。一抗PTRF兔單克隆抗體1：100稀釋,caveolinl兔單克隆抗體1：150稀釋。Poly peroxidase兔多聚過氧化物酶IgG作為二抗,切片由光學(xué)顯微鏡分析。陰性對(duì)照同樣用一抗檢測(cè)。免疫印跡部分由光學(xué)顯微鏡檢查,物鏡和目鏡10x40。免疫印記強(qiáng)度使用圖像處理軟件pro-Plus6.0處理。 14、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果均為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。統(tǒng)計(jì)分析使用一個(gè)方差分析(方差分析)或t檢驗(yàn)。同一GBM標(biāo)本中PTRF和Caveolin-1mRNA水平之間的關(guān)系使用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)。當(dāng)P值小于0.05被認(rèn)為是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)分析使用SPSS13.0軟件完成。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、通過持續(xù)的伊馬替尼刺激U251細(xì)胞,我們構(gòu)建了耐伊馬替尼的GBM細(xì)胞株U251AR,同時(shí)我們檢測(cè)到U251AR對(duì)VP-16和TMZ產(chǎn)生耐藥。為了維持U251AR的多藥耐藥性,我們?cè)谂囵B(yǎng)U251AR的培養(yǎng)液中加入伊馬替尼(122μg/毫升)。本研究發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)胞株U251AR的一些耐藥基因表達(dá)與U251相比明顯高表達(dá)。我們通過免疫印跡檢測(cè)ATP-依賴性藥物外泵(P-gp)蛋白的表達(dá),并用定量RT-PCR法對(duì)U251AR和U251細(xì)胞中和P-gp、MRP1和BCRP mRNA水平進(jìn)行測(cè)定。耐藥細(xì)胞株U251AR中P-gp, MRP1和BCRP的表達(dá)增加(*,P0.05)。這些結(jié)果表明,耐伊馬替尼的GBM細(xì)胞株U251AR構(gòu)建成功。 2、為獲得U251和U251AR細(xì)胞整體蛋白情況,我們使用三個(gè)雙向凝膠電泳檢測(cè)兩種細(xì)胞系中不同蛋白質(zhì)的表達(dá)。對(duì)于每個(gè)凝膠,綜合后的圖像源于U251,U251AR和內(nèi)參樣本。與Cy3和Cy5-標(biāo)記圖像的代表DIGE凝膠如圖所示。使用DeCyder軟件在DIA工作區(qū)共發(fā)現(xiàn)2516-2735斑點(diǎn)。在BVA模塊中,U251AR與U251相比,按給定的標(biāo)準(zhǔn)的比率大于1.5或小于1.5(P值0.05),41個(gè)斑點(diǎn)差異表達(dá),其中23個(gè)斑點(diǎn)衰減和18個(gè)斑點(diǎn)上調(diào)。由于部分蛋白由于表達(dá)水平低,導(dǎo)致考馬斯藍(lán)凝膠未能檢測(cè)到相應(yīng)斑點(diǎn)。MALDI-TOF/TOF MS分析發(fā)現(xiàn),兩個(gè)細(xì)胞系中有21個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)表達(dá)量顯著改變。包括PTRF和VIM在內(nèi)的21個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)中,U251AR細(xì)胞株9個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào),12個(gè)蛋白下調(diào)。 3、為了驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果,我們通過免疫印跡和定量RT-PCR檢鋇PTRF和VIM的表達(dá)。與之前的結(jié)果一樣,免疫印跡和定量RT-PCR結(jié)果證實(shí)PTRF和VIM在U251AR中表達(dá)量均高于U251細(xì)胞(*,p0.05)。為了檢鋇PTRF及caveolinl在兩種細(xì)胞株中的表達(dá)量及表達(dá)部位,我們采用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)U251AR和U251細(xì)胞中PTRF和caveolinl的定位及定量。PTRF在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá),U251AR細(xì)胞質(zhì)中的熒光度大于U251。Caveolinl同樣在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中同時(shí)表達(dá),且在U251AR的熒光度大于U251,以上表明U251AR比U251細(xì)胞可能擁有更多細(xì)胞質(zhì)膜微囊。 4、為進(jìn)一步檢測(cè)PTRF在GBM細(xì)胞中耐藥性中的作用,我們通過pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA敲除U251和U251AR細(xì)胞系中PTRF的表達(dá)。干擾效果由Western blotting和定量RT-PCR證實(shí)(*,P0.05)。我們同時(shí)檢測(cè)了干擾組細(xì)胞的caveolin1和P-gp的mRNA水平,與我們的預(yù)期及文獻(xiàn)報(bào)道相同,干擾組細(xì)胞的caveolinl和P-gp的mRNA表達(dá)水平與U251及U251AR相比也降低。 PTRF和caveolinl細(xì)胞質(zhì)微囊的兩個(gè)重要結(jié)構(gòu),均被證實(shí)與腫瘤化療耐藥有關(guān)。為了檢測(cè)PTRF對(duì)細(xì)胞活力的影響,我們對(duì)U251、U251AR及敲除PTRF的細(xì)胞系加入TMZ(100μg/毫升)(24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí))后對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行分析。分析得出,在相同的TMZ濃度下,與U251、U251AR細(xì)胞相比,敲除PTRF后細(xì)胞生存能力明顯降低(*,P0.05) 為檢鋇PTRF在GBM化學(xué)藥物敏感性中的作用,U251細(xì)胞、U251AR細(xì)胞和轉(zhuǎn)染細(xì)胞中加入伊馬替尼,VP-16和TMZ三種藥物之后,通過CCK8檢測(cè)法測(cè)定其的IC50值。在加入伊馬替尼,VP-16, TMZ后,shPTRF轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的IC50值較U251和U251AR細(xì)胞顯著下降了2.05-3.92倍(**,P0.01),表明PTRF的下調(diào)可增加GBM對(duì)化療藥物的敏感性。 5、為了研究PTRF在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤耐藥中的作用,我們通過免疫組化法檢測(cè)58例星形細(xì)胞瘤患者和6例復(fù)發(fā)患者GBM組織中PTRF的表達(dá)。此外,8例正常腦組織被用作對(duì)照樣本。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)：PTRF在低級(jí)星形細(xì)胞瘤(Ⅰ和Ⅱ級(jí))和正常腦組織標(biāo)本中低表達(dá),但在高級(jí)別星形細(xì)胞瘤(Ⅲ和Ⅳ級(jí))中高度表達(dá)。我們還發(fā)現(xiàn),PTRF在TMZ化療6個(gè)月后復(fù)發(fā)的GBM患者中的表達(dá)水平高于未經(jīng)化療的患者。與PTRF一樣,caveolinl在復(fù)發(fā)GBM患者中的表達(dá)水平同樣增高。此外,GBM復(fù)發(fā)患者PTRF和caveolinl的mRNA水平明顯高于原發(fā)的GBM患者(*,P0.01)。由于PTRF和caveolinl在生物學(xué)特性及功能方面都是細(xì)胞質(zhì)微囊的兩個(gè)基本組成部分,因此,我們對(duì)同一GBM標(biāo)本的PTRF和caveolin1mRNA水平做相關(guān)分析。研究表明,PTRF mRNA水平與caveolinl mRNA水平在同一GBM標(biāo)本中呈正相關(guān)(2-tailed Pearson相關(guān),r=0.766,P0.01)。這些結(jié)果表明,在同一GBM標(biāo)本中PTRF的表達(dá)水平可能與caveolinl的表達(dá)水平相關(guān)。 結(jié)論： 1、通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法,我們揭示了GBM的耐藥性相關(guān)的眾多因子。 2、在這些因子中,在GBM的耐藥性上PTRF可能扮演著重要角色。 3、我們發(fā)現(xiàn)GBM標(biāo)本的PTRF表達(dá)上調(diào)并在GBM復(fù)發(fā)患者樣本中表達(dá)水平更高。 4, PTRF可能作為GBM的生物標(biāo)志物利于早期診斷和預(yù)后分析,成為GBM的潛在治療靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.41

【共引文獻(xiàn)】

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5 謝琴;高召兵;;離子通道與腫瘤相關(guān)性的研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2014年10期

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本文編號(hào)：2565210