【摘要】：研究背景及目的:腦出血作為腦卒中的一種亞型,通常指血管破裂所引起的腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血,常引起很高的致死率和致殘率。截至目前,尚缺乏有效的治療手段。隨著人口老齡化的加重,更需要引起重視。腦出血病理機(jī)制復(fù)雜,初級損害常常由血腫引起的機(jī)械占位效應(yīng)引起,繼而引發(fā)次級損害,即由血腫周圍的水腫所引發(fā)的占位效應(yīng)、炎癥、凋亡和壞死導(dǎo)致。針對初級損害目前尚缺乏有效的治療手段,而針對腦出血后腦水腫所引發(fā)的不良結(jié)果,目前已有一些研究表明針對其干預(yù)的有效性,尤其是腦出血后炎癥免疫反應(yīng)在腦損傷中的作用,可作為可能有效的干預(yù)靶點(diǎn)。磷脂酰鞘氨醇1(S1P)作為G蛋白偶聯(lián)受體調(diào)節(jié)劑具有S1P1-S1P5這5個亞型,在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)過程中均發(fā)揮重要作用。新近研究表明芬戈莫德(FTY720)作為口服治療多發(fā)性硬化的非選擇性S1P受體調(diào)節(jié)劑能夠改善實(shí)驗(yàn)動物和患者腦出血后的神經(jīng)功能缺損并減輕腦水腫,并主要通過S1P1受體發(fā)揮作用。同時,一些研究也表明其非選擇性的調(diào)節(jié)作用也可能引起不良反應(yīng)。RP101075作為選擇性S1P1受體調(diào)節(jié)劑具備優(yōu)越的特異選擇性和良好的心血管安全性。本實(shí)驗(yàn)旨在研究特異性選擇性免疫性調(diào)節(jié)S1P1受體在實(shí)驗(yàn)性腦出血模型中的治療作用及可能的機(jī)制探索。研究方法:本實(shí)驗(yàn)分別采用C57BL/6小鼠和Rag2~(-/-)小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象,采用自體血注射誘導(dǎo)腦出血模型。腦出血小鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、安慰劑治療組、RP101075治療組、RP101075和W146(S1P1受體阻滯劑)共同治療組和FTY720治療組,采用灌胃的給藥方式連續(xù)給藥3天,并從術(shù)后30分鐘后開始給藥,每天給藥一次,并在術(shù)后相應(yīng)時間點(diǎn)應(yīng)用改良神經(jīng)功能評分、轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)、前爪放置實(shí)驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評價(jià),同時包括14天的生存率評價(jià),利用核磁、干濕重方法評價(jià)腦水腫,應(yīng)用核磁評價(jià)血腫體積,血紅蛋白定量測定腦血腫含量,并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定腦內(nèi)和外周的免疫炎性細(xì)胞浸潤,包括小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞、CD4~+T細(xì)胞、CD8~+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞、炎癥因子TNF-α、IL-1β表達(dá),應(yīng)用伊文斯蘭定量定性測定血腦屏障滲漏和蛋白印跡法檢測緊密連接蛋白表達(dá),以及體內(nèi)體外對神經(jīng)元凋亡的檢測。研究結(jié)果:選擇性S1P1受體調(diào)節(jié)劑RP101075能夠有效改善腦出血小鼠的神經(jīng)功能缺損、生存率和腦水腫。W146能夠阻滯RP101075在腦水腫和神經(jīng)功能方面的治療作用。同時,RP101075能夠減少小鼠腦出血后腦內(nèi)和外周淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤和炎癥因子表達(dá),并且能夠提高血腦屏障完整性、減少神經(jīng)元凋亡。研究結(jié)論:研究表明選擇性S1P1受體調(diào)節(jié)劑RP101075能夠在實(shí)驗(yàn)性腦出血中提供神經(jīng)保護(hù)功能,同時鑒于其藥理學(xué)方面的優(yōu)勢,說明利用RP101075選擇性調(diào)節(jié)S1P1受體在實(shí)驗(yàn)性腦出血中具備有效的治療作用和轉(zhuǎn)化研究價(jià)值,值得進(jìn)一步研究。
【圖文】：

圖 1. 小鼠腦出血模型采用改良取血注射方法，將小鼠內(nèi)眥取血 30 微升，然后迅速將 30 微升未凝固的血液轉(zhuǎn)移到微量注射器的針筒中，針頭的規(guī)格為 26G，并確保針頭血液流暢，然后固定于注射泵上。將取血后的小鼠俯臥固定于立體定位儀，剃去頭頂處毛發(fā)后，采用碘伏擦拭消毒，并用手術(shù)刀沿中線切開約 1 厘米的切口，擦拭掉軟組織后，找到前囟點(diǎn)，，作為原點(diǎn)，并在前囟點(diǎn)的前方 0.3 毫米、右側(cè) 2.5 毫米處標(biāo)記注射點(diǎn)，然后用鉆頭鉆開一個直徑約 1 毫米的注射孔后，將固定好的微量注射注射器針頭沿注射孔進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，深度確定為 3.5 毫米，注射速度為每分鐘2 微升，采用雙次注射方法，第一次注射量為 5 微升，然后稍作停留，然后繼續(xù)以每分鐘 2 微升的速度緩慢注射，注射完成后，停針約 20 分鐘左右，然后分 3次取出針頭，每次 1 毫米，取出注射針頭后，消毒傷口，縫合傷口。假手術(shù)組用同樣的針頭刺入相同位置相同深度但不注入血液。

圖 2. 實(shí)驗(yàn)流程圖在制作腦出血模型前，對基線期小鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評價(jià)作為對照。采用自體血注射基底節(jié)區(qū)小鼠腦出血模型，注射 30 微升自體血，術(shù)后 30 分鐘開始采用灌胃方式給予溶劑、RP101075、RP101075+W146 干預(yù)，連續(xù)給藥 3 天。在術(shù)后第 1 天，進(jìn)行神經(jīng)功能評價(jià)，包括 mNSS 評分、前爪放置實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)角實(shí)驗(yàn)。同時進(jìn)行核磁掃描，包括 SWI 序列和 T2 序列，評價(jià)血腫體積和腦水腫。同時進(jìn)行大體測量和血紅蛋白定量測定血腫體積和腦血紅蛋白含量測定，應(yīng)用干濕重評價(jià)腦水腫情況。并運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)評價(jià)腦內(nèi)、外周血和脾的免疫炎癥情況。術(shù)后第 3 天，神經(jīng)功能、腦水腫、血腫和免疫情況測量同術(shù)后第一天，并同時應(yīng)用伊文斯藍(lán)測定血腦屏障滲漏，應(yīng)用蛋白印記檢測緊密連接蛋白表達(dá)，同時檢測細(xì)胞凋亡情況。整體觀察術(shù)后 14 天生存率。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R743.34

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