【摘要】：目的通過(guò)制備新生大鼠缺氧缺血性腦損傷(Hypoxic ischemic brain damage,HIBD)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,同時(shí)給予中藥銀杏內(nèi)酯B(Ginkgolide B,GB)、PI3K-AKT信號(hào)通路抑制劑(LY294002)、MEK-ERK信號(hào)通路抑制劑(U0126)進(jìn)行干預(yù),觀察HIBD后各組大鼠腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Brain-derived neutrophic factor,BDNF)、磷酸化-AKT(ser473)[P-AKT(ser473)]、磷酸化-ERK1/2(P-ERK1/2)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3,CC3)的表達(dá)水平及神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況,探討銀杏內(nèi)酯B對(duì)HIBD后新生大鼠腦BDNF表達(dá)的影響,以及PI3K-AKT/MEK-ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路在銀杏內(nèi)酯B抗HIBD新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用,以期為缺氧缺血性腦損傷治療開(kāi)辟新途徑和新思路,減少HIBD后遺癥的發(fā)生。方法首先將160只SPF級(jí)新生7日齡SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分4組:假手術(shù)組(Sham組)、缺氧缺血組(HI組)、GB_(低劑量組)(10mg/Kg)和GB_(高劑量組)(20mg/Kg),其中,GB治療組于缺氧缺血后0h、24h經(jīng)腹腔給藥,且各組分別于術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)(6h、12h、24h、48h)隨機(jī)處死大鼠各10只,斷頭取腦,采用聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)BDNFmRNA及Caspase-3mRNA的表達(dá)水平,篩選出效應(yīng)強(qiáng)度最佳時(shí)間點(diǎn),即為缺氧缺血后24h,且GB_(高劑量組)效果優(yōu)于GB_(低劑量組)。然后將另外140只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為7組:假手術(shù)組(Sham組)、缺氧缺血組(HI組)、GB組(20mg/Kg),LY294002組、GB+LY294002組、U0126組、GB+U0126組,每組各20只。其中,LY294002組和GB+LY294002組均于造模前30min給予LY294002(1.8mg/Kg),U0126組和GB+U0126組均于造模前30min給予U0126(0.2mg/Kg);參照經(jīng)典Rice法制備HIBD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,GB組、GB+LY294002組和GB+U0126組均于造模后即刻經(jīng)腹腔注射銀杏內(nèi)酯B(20mg/Kg),然后各組于缺氧缺血后24h斷頭取腦。蘇木精-伊紅染色法(HE染色)觀察腦白質(zhì)病理改變,原位切口末端標(biāo)記法法(TUNEL)檢測(cè)腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況,同時(shí)分別采用免疫組化和Western blotting對(duì)腦組織中BDNF、P-AKT(ser473)、P-ERK1/2及CC3蛋白進(jìn)行定位和定量。數(shù)據(jù)以sx±表示,采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,定量資料多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t法,以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果1聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)結(jié)果銀杏內(nèi)酯B可抑制缺氧缺血后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織Caspase-3mRNA上調(diào),同時(shí)促進(jìn)缺氧缺血后BDNFmRNA表達(dá),發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能。具體結(jié)果如下:與Sham組比較,缺氧缺血后6 h HI組和兩治療組大鼠腦Caspase-3mRNA開(kāi)始出現(xiàn)升高,BDNFmRNA開(kāi)始下降;12h Caspase-3mRNA進(jìn)一步上升,BDNFmRNA進(jìn)一步下調(diào),至24 h分別達(dá)到峰值和谷值,隨后Caspase-3mRNA呈下調(diào)趨勢(shì),BDNFmRNA也有所回升。但各時(shí)間點(diǎn)兩治療組Caspase-3mRNA水平均低于HI組,BDNFmRNA水平均高于HI組,且HIBD后24h差距最明顯,GB_(高劑量組)效果優(yōu)于GB_(低劑量組)。2蘇木精-伊紅染色(HE)結(jié)果銀杏內(nèi)酯B可減輕HIBD新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞水腫。具體結(jié)果如下:Sham組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常,胞漿、胞核分別被染成粉紅色與深藍(lán)色;缺氧缺血后24 h,HI組神經(jīng)細(xì)胞水腫較為明顯,呈空泡樣或氣球樣改變,同時(shí)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯腫脹;GB治療組(20mg/kg)細(xì)胞水腫有所減輕,僅少部分細(xì)胞出現(xiàn)水泡樣改變。3原位切口末端標(biāo)記法(TUNEL)結(jié)果銀杏內(nèi)酯B可減輕HIBD新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡。具體結(jié)果如下:Sham組僅可見(jiàn)個(gè)別凋亡細(xì)胞;與Sham組比較,HI組和GB組(20mg/kg)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與HI組比較,GB組凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)有所降低,差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。4免疫組織化學(xué)結(jié)果銀杏內(nèi)酯B可抑制缺氧缺血誘導(dǎo)的CC3陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)增加,同時(shí)上調(diào)BDNF和P-AKT(ser473)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù),減少缺氧缺血性腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平,且這一作用可被LY294002抑制劑所抑制。具體結(jié)果如下:與Sham組比較,HI組大鼠腦BDNF和P-AKT(ser473)陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞減少,而凋亡因子CC3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞增多,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);此外,與HI組比較,GB組(20mg/Kg)BDNF和P-AKT(ser473)陽(yáng)性細(xì)胞增多,CC3陽(yáng)性細(xì)胞減少,差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);然而,各組間大鼠腦P-ERK1/2陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)均較少,且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與GB(20 mg/kg)治療組比較,LY294002組和GB+LY294002組大鼠腦BDNF和P-AKT(ser473)陽(yáng)性細(xì)胞減少,CC3陽(yáng)性細(xì)胞增多,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而LY294002組和GB+LY294002組相比,上述蛋白陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與U0126組比較,GB組和GB+U0126組大鼠腦BDNF陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞增多,而CC3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與GB組比較,GB+U0126組BDNF及CC3陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)明顯變化,而P-ERK1/2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5蛋白印記結(jié)果銀杏內(nèi)酯B可抑制缺氧缺血誘導(dǎo)的CC3蛋白表達(dá)水平增加,同時(shí)上調(diào)腦組織中BDNF和P-AKT(ser473)蛋白表達(dá)水平,發(fā)揮抗缺氧缺血腦損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用,且這一作用可被LY294002抑制劑所抑制;而P-ERK1/2蛋白表達(dá)水平對(duì)銀杏內(nèi)酯B功能的發(fā)揮無(wú)明顯的影響。具體結(jié)果如下:與Sham組比較,HI組大鼠腦BDNF及P-ATK(ser473)蛋白表達(dá)有所下調(diào),凋亡因子CC3表達(dá)明顯上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與HI組比較,GB組(20mg/Kg)大鼠腦BDNF及P-ATK(ser473)蛋白表達(dá)量增多,CC3蛋白表達(dá)有所減低,差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);然而,以上各組P-ERK1/2蛋白表達(dá)水平均較低且無(wú)明顯變化趨勢(shì);與GB組(20mg/Kg)相比,LY294002組和GB+LY294002組大鼠腦BDNF和P-AKT(ser473)蛋白表達(dá)量明顯降低,凋亡因子CC3蛋白含量明顯升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而LY294002組和GB+LY294002組相比,上述蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯變化,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與U0126組比較,GB和GB+U0126兩組大鼠腦BDNF和P-AKT(ser473)蛋白表達(dá)水平均上調(diào),凋亡因子CC3蛋白表達(dá)水平均下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而U0126組和GB+U0126組大鼠腦P-ERK1/2蛋白表達(dá)水平極低,與GB組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1銀杏內(nèi)酯B能夠抑制缺氧缺血后新生大鼠腦組織Caspase-3mRNA上調(diào)及BDNFmRNA下調(diào),且于HIBD后24h抑制程度最明顯,GB_(高劑量組)效果優(yōu)于GB_(低劑量組);2銀杏內(nèi)酯B能夠下調(diào)缺氧缺血后新生大鼠腦CC3蛋白表達(dá)水平,減輕腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡;3銀杏內(nèi)酯B能夠促進(jìn)HIBD后新生大鼠腦BDNF分泌,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用;4 PI3K/AKT信號(hào)通路在銀杏內(nèi)酯B抗缺氧缺血性腦損傷新生大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著重要作用;而MEK/ERK信號(hào)通路對(duì)銀杏內(nèi)酯B神經(jīng)保護(hù)作用的發(fā)揮無(wú)明顯的影響。
【圖文】：

2圖 1.1 細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制 圖 1.2 生長(zhǎng)因子拮抗細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制加劇海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Kokaia 等人[10]通過(guò)觀察比較缺血損傷后海馬不同區(qū)域BDNF 表達(dá)水平與抗缺血能力之間的關(guān)系，也證實(shí)了內(nèi)源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子的保護(hù)功能。Schabitz 等學(xué)者[6]發(fā)現(xiàn) BDNF 能明顯降低大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞后腦梗死面積及 Bcl-2、Bax 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)。此外，BDNF 能顯著促進(jìn)大鼠暫時(shí)性前額缺血后海馬 CA1 區(qū)錐形神經(jīng)元的存活[11]。以上功能主要與細(xì)胞表面 2 個(gè)重要受體即酪氨酸激酶受體 B（TrkB）和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體 p75 的活化有關(guān)[4]，并且前者的激活是該功能必不可少的環(huán)節(jié)[12]。國(guó)外許多體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明：BDNF 與 TrkB 受體結(jié)合后可通過(guò)激活MEK-ERK 通路或 PI3K-AKT 通路來(lái)發(fā)揮抗神經(jīng)元凋亡作用[13]，這與神經(jīng)細(xì)胞類型、損傷因素及培養(yǎng)條件有關(guān)[14]。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也表明：BDNF-TrkB-PI3K/AKT 通路在血紅素加氧酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）及

2圖 1.1 細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制 圖 1.2 生長(zhǎng)因子拮抗細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制加劇海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Kokaia 等人[10]通過(guò)觀察比較缺血損傷后海馬不同區(qū)域BDNF 表達(dá)水平與抗缺血能力之間的關(guān)系，也證實(shí)了內(nèi)源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子的保護(hù)功能。Schabitz 等學(xué)者[6]發(fā)現(xiàn) BDNF 能明顯降低大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞后腦梗死面積及 Bcl-2、Bax 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞計(jì)數(shù)。此外，BDNF 能顯著促進(jìn)大鼠暫時(shí)性前額缺血后海馬 CA1 區(qū)錐形神經(jīng)元的存活[11]。以上功能主要與細(xì)胞表面 2 個(gè)重要受體即酪氨酸激酶受體 B（TrkB）和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體 p75 的活化有關(guān)[4]，并且前者的激活是該功能必不可少的環(huán)節(jié)[12]。國(guó)外許多體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明：BDNF 與 TrkB 受體結(jié)合后可通過(guò)激活MEK-ERK 通路或 PI3K-AKT 通路來(lái)發(fā)揮抗神經(jīng)元凋亡作用[13]，，這與神經(jīng)細(xì)胞類型、損傷因素及培養(yǎng)條件有關(guān)[14]。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也表明：BDNF-TrkB-PI3K/AKT 通路在血紅素加氧酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）及
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R742

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2562509