【摘要】：研究背景： 腦內(nèi)多藥耐藥基因1(multidrug resistance-1, mdrl)編碼的P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)等腦內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運體過表達(dá),是耐藥性癲癇(Drug-Resistant Epilepsy, DRE)發(fā)生的主要機(jī)制之一。新近研究發(fā)現(xiàn),炎癥反應(yīng)可能是所有類型癲癇發(fā)生發(fā)展的一個共同的危險因素,癲癇相關(guān)炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)腦內(nèi)P-gp過表達(dá)。高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box-1, HMGB1)是主要炎癥激活因子,作用于模式識別受體如Toll樣受體4(Toll Like Receptor4, TLR4)等介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng),降低癲癇發(fā)作的閾值,加重癲癇發(fā)作,可能與DRE的形成有關(guān)。其他諸多非癲癇領(lǐng)域的研究已證實,TLR4激活是啟動核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B(nuclear factor-kappa B, NF-κB)經(jīng)典活化信號通路的重要途徑；而NF-κB活化是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié),參與了癲癇急、慢性炎癥反應(yīng),且與P-gp過表達(dá)有關(guān)；動物實驗已證實HMGB1可促使胃腺癌P-gp過表達(dá),那么癲癇腦內(nèi)高表達(dá)的HMGB1是否介導(dǎo)P-gp過表達(dá),是否通過HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路調(diào)控癲癇腦內(nèi)P-gp過表達(dá),目前未見相關(guān)報道。 第一部分HMGB1及其拮抗劑BoxA對癲癇大鼠海馬P-糖蛋白表達(dá)的影響 目的： 探討HMGB1及其拮抗劑BoxA對癲癇大鼠腦P-糖蛋白表達(dá)的影響。 方法： 將雄性SD大鼠隨機(jī)分組為假手術(shù)組、癲癇組、低、中、高劑量HMGB1干預(yù)組,每組12只；低、中、高劑量BoxA干預(yù)組,每組6只。采用海馬微量注射海人酸(kainic acid, KA,3μl,0.5μg/μl)制作癲癇大鼠模型,HMGB1干預(yù)組、BoxA干預(yù)組于注射KA前15min,分別側(cè)腦室微量注射10μl不同劑量重組HMGB1(10、100、1000ng)蛋白或不同劑量BoxA (14、140、1400ng)進(jìn)行干預(yù)。記錄癲癇大鼠自注射KA后至初次達(dá)到Ⅲ級發(fā)作的時間(Seizure Onset Time, SOT),作為評價癲癇發(fā)作易感性指標(biāo)；造模成功24h后處死大鼠,分別采用免疫組化法、實時定量熒光PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法,檢測并比較各組大鼠海馬組織損傷、多藥耐藥基因1(multidrug resistance-1, mdr1) mRNA及其蛋白P-gp的表達(dá)。 結(jié)果： 與癲癇組比較：中、高劑量HMGB1干預(yù)組SOT縮短(P0.05),海馬組織結(jié)構(gòu)紊亂,海馬CA3區(qū)神經(jīng)元過度丟失(P0.05),海馬mdr1a/b mRNA及P-gp表達(dá)增加(P0.05)；而低劑量HMGB1干預(yù)組與癲癇組比較,以上各項指標(biāo)差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。中、高劑量BoxA干預(yù)組與癲癇組比較,其mdr1a/b mRNA及P-gp表達(dá)水平低于癲癇組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與癲癇組比較,低劑量BoxA干預(yù)組mdr1a mRNA表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而mdr1b mRNA及P-gp表達(dá)雖下降,但差異則未顯示統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： HMGB1可增加癲癇鼠發(fā)作易感性,加重海馬組織損傷,促進(jìn)海馬組織P-gp過表達(dá),其拮抗劑BoxA可抑制海馬P-gp過表達(dá),提示HMGB1可調(diào)控癲癇鼠腦P-gp表達(dá)。 第二部分HMGB1/TLR4/NF-KB信號通路對癲癇小鼠海馬P-gp表達(dá)的調(diào)控作用 目的： 探討HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路對癲癇小鼠海馬P-gp表達(dá)的調(diào)控作用。 方法： 1.建立急性癲癇小鼠模型,將雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分組為假手術(shù)組、癲癇組、HMGB1干預(yù)組、BoxA干預(yù)組,每組12只；另用HMGB1干預(yù)野生型雄性小鼠、TLR4基因敲除型小鼠,每組6只。采用海馬微量注射KA(0.5pl,0.014μg/μl)制作急性癲癇小鼠模型,HMGB1干預(yù)組、BoxA干預(yù)組于注射KA前15min,分別通過海馬微量注射重組HMGB1(1μl,5.5μg/μl)或BoxA (1μl,2.5μg/μl)蛋白進(jìn)行干預(yù)。干預(yù)24h后處死小鼠,分別采用免疫組化法和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測并比較各組大鼠海馬組織損傷及HMGB1、TLR4、IκB激酶亞基β (IKKβ)、NFκB-p65亞基(p-65)、磷酸化NFκB-p65亞基(p-p-65)、P-gp等蛋白表達(dá)。 2.建立慢性癲癇小鼠模型,將雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分組為假手術(shù)組、癲癇組、HMGB1干預(yù)組、BoxA干預(yù)組,每組6只。采用海馬微量注射KA(0.05μl,4μg/μl)制作慢性癲癇小鼠模型,造模成功14d后,HMGB1干預(yù)組、BoxA干預(yù)組分別通過海馬微量注射重組HMGB1(1μl,5.5μg/μl)或BoxA (1μl,2.5μg/μl)蛋白進(jìn)行干預(yù)。干預(yù)24h后處死小鼠,采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測并比較各組大鼠海馬組織p-p65、P-gp的表達(dá)。 結(jié)果： 1.在急性癲癇小鼠模型中,與癲癇組比較,HMGB1干預(yù)組海馬CA1區(qū)組織結(jié)構(gòu)紊亂,神經(jīng)元過度丟失,P-gp染色陽性細(xì)胞計數(shù)百分比升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05); BoxA干預(yù)組與癲癇組比較,CA1區(qū)組織結(jié)構(gòu)紊亂,神經(jīng)元過度丟失較輕,P-gp染色陽性細(xì)胞計數(shù)百分比下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。HMGB1干預(yù)組與癲癇組比較,HMGB1、TLR4、IKK β、p-65、p-p-65、P-gp等蛋白表達(dá)均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而BoxA干預(yù)組與癲癇組相比,僅HMGB1、TLR4、p-p-65、P-gp等蛋白表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。TLR4基因敲除型小鼠與野生型小鼠比較,p-p-65、P-gp等蛋白表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 2.在慢性癲癇小鼠模型中,與癲癇組比較,HMGB1干預(yù)組p-p-65、P-gp表達(dá)均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與癲癇組比較,BoxA干預(yù)組p-p-65表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),雖其P-gp表達(dá)下降,但差異未顯示統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： HMGB1可通過激活TLR4,誘導(dǎo)NF-κB信號通路促進(jìn)癲癇小鼠腦P-gp過表達(dá)。
【圖文】：

圖1.1 HMGBl對大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元損傷的影響（X400)EPS、H1000組各5只大鼠，其它組各6只大鼠。NeuN染色陽性細(xì)胞呈棕色，癲癇組陽性細(xì)胞計數(shù)低丁.3113111組，中、高劑量HMGB1干預(yù)組其計數(shù)低丁?癲癇組(與癲癇組相比*P<0.ft5)。A BCHMGBl — — — 廣30Kd g 2 ?P -aCtin ^mm ~42 Kd 2 ^ g ?sham EP HI。HlOO 111000 S N _ ■iiiul2 sham EP H10 H100 H1000圖1.2大鼠海馬組織HMGBl蛋白的表達(dá)水平檢測A、B分別為HMGBl蛋白免疫印跡圖片及其相對表達(dá)量，每組6只大鼠，■Mvr癇組相比0<0.05，i-j sham組比較28

EP組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均1.1.3大鼠海馬組織HMGB1蛋白的表達(dá)水平檢測，見圖1.2。各組HMGB1表達(dá)總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.(W/),與sham組比較，EP組HMGB1的表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義CP<0.05);中、高劑量HMGB1干預(yù)組HMGB1表達(dá)水平均高于EP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義iP<0.05'),低劑量HMGB1干預(yù)組HMGB1表達(dá)水平高于EP組，而差異則無統(tǒng)計學(xué)意義。1.1.4 HMGB1對大鼠海馬組織P-gp表達(dá)的影響。1) Western blot示HMGB1對大鼠海馬組織P-gp表達(dá)的影響，見圖1.3。各組P-gp表達(dá)總體差異均有統(tǒng)計學(xué)意義EP組P-gp的表達(dá)水平高于sham組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<ft05);中、高劑量HMGB1干預(yù)組P-gp表達(dá)水平均高于EP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（尸<a(?J)
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R742.1

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 郝勁博;高遷移率族蛋白B1對癲癇大鼠神經(jīng)損傷及腦P糖蛋白表達(dá)的影響及機(jī)制[D];南京醫(yī)科大學(xué);2014年

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本文編號：2561148