【摘要】：第一部分SD大鼠Schwann細(xì)胞、DRGn、BMSCs原代培養(yǎng) 【目的】建立一系列（包括SD大鼠Schwann細(xì)胞、DRGn、BMSCs）取材容易、細(xì)胞存活時(shí)間長(zhǎng)、純度高的、培養(yǎng)穩(wěn)定的原代培養(yǎng)模型，為后續(xù)細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性提供保障。 【方法】1.SD大鼠Schwann細(xì)胞原代培養(yǎng)：取15只出生1天的SD乳鼠，在體視解剖顯微鏡下獲取坐骨神經(jīng)和臂叢神經(jīng)，聯(lián)合應(yīng)用I型膠原酶和胰酶進(jìn)行消化，使用含有刺激因子forskolin和牛垂體提取物（BPE）的F12/DMEM1:1培養(yǎng)基聯(lián)合抗有絲分裂藥物和無(wú)血清培養(yǎng)純化等方法獲得Schwann細(xì)胞。采用雪旺氏細(xì)胞標(biāo)志物S100蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色法和hoechst染核鑒定并測(cè)定Schwann細(xì)胞的純度。2.SD胎鼠DRGn原代培養(yǎng)：在解剖顯微鏡下取得E16（懷孕第16天）胎鼠背根神經(jīng)節(jié)，通過(guò)胰蛋白酶消化，使用無(wú)血清培養(yǎng)基聯(lián)合抗有絲分裂來(lái)獲得高純度的DRG神經(jīng)元。采用NF200細(xì)胞免疫熒光鑒定DRGn和純度檢測(cè)。3.SD大鼠BMSCs原代培養(yǎng)：將大鼠的股骨和脛骨在動(dòng)物房手術(shù)臺(tái)取出，轉(zhuǎn)移入細(xì)胞原代培養(yǎng)超凈臺(tái)中用剪刀把股骨和脛骨從中間剪斷，沖洗骨髓腔獲得骨髓，通過(guò)貼壁和傳代培養(yǎng)來(lái)純化BMSCs，培養(yǎng)至第8代（P8）的BMSCs用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)表面抗原CD29，CD44,CD45的表達(dá)率來(lái)鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和計(jì)算其純度�！窘Y(jié)果】1.SD大鼠雪旺氏細(xì)胞原代培養(yǎng)：雪旺氏細(xì)胞在含有 forskolin和牛腦垂體提取液的F12/DMEM1:1培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，生長(zhǎng)速度快，純度可達(dá)到98%以上。2.SD胎鼠DRGn原代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)的DRGn在含有神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）的NB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，存活時(shí)間可達(dá)45d，純度可達(dá)到95%以上。3.SD大鼠BMSCs原代培養(yǎng)：在傳到第8代時(shí)，可以得到純度較高的BMSCs，此時(shí)經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，P8代BMSCs表達(dá)抗原具有很高的均一性，CD29和CD44強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而CD45只有很少的表達(dá)，說(shuō)明培養(yǎng)的BMSCs可以滿足本實(shí)驗(yàn)及后續(xù)研究的需要�！窘Y(jié)論】本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的原代SD大鼠Schwann細(xì)胞、DRGn、BMSCs細(xì)胞活性良好，純度高，適用于共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。一、慢病毒介導(dǎo)GFP綠色熒光蛋白標(biāo)記BMSCs 【目的】探討慢病毒感染BMSCs介導(dǎo)GFP標(biāo)記大鼠BMSCs的適宜條件，以獲得穩(wěn)定高表達(dá)綠色熒光蛋白的BMSCs。為共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的動(dòng)態(tài)觀察奠定基礎(chǔ)。 【方法】用攜帶GFP基因的載體質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)組裝含GFP的慢病毒，隨后對(duì)慢病毒進(jìn)行滴度檢測(cè)，分別以MOI值為10，20，40感染BMSCs細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡觀察各組的感染效率和熒光強(qiáng)度以及轉(zhuǎn)然后的形態(tài)變化，MTT法檢測(cè)慢病毒感染對(duì)BMSCs增殖的影響，從而確定適宜的感染條件。 【結(jié)果】MOI=10轉(zhuǎn)染效率為（62.2±2.3）%，MOI=20轉(zhuǎn)染效率為（93.2±1.8）%,MOI=40轉(zhuǎn)染效率無(wú)明顯增加。感染對(duì)BMSCs增殖無(wú)影響。 【結(jié)論】MOI值為20是慢病毒載體介導(dǎo)GFP標(biāo)記BMSCs的適宜條件，GFP綠色熒光蛋白能在BMSCs中穩(wěn)定表達(dá)，BMSCs的增殖分化不受影響【關(guān)鍵詞】慢病毒，GFP，，BMSCs，MOI 二、BMSCs與DRGn共培養(yǎng) 【目的】建立GFP標(biāo)記的BMSCs與DRGn共培養(yǎng)模型。 【方法】GFP綠色熒光蛋白標(biāo)記的BMSCs與DRGn共培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察BMSCs誘導(dǎo)分化Schwann細(xì)胞樣細(xì)胞的時(shí)間和數(shù)量。 【結(jié)果】GFP標(biāo)記的BMSCs與DRGn共培養(yǎng)3天后可觀察到Schwann細(xì)胞樣細(xì)胞出現(xiàn)；共培養(yǎng)7天后能觀察到典型的Schwann細(xì)胞樣細(xì)胞出現(xiàn)。隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)Schwann細(xì)胞樣細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。 【結(jié)論】DRGn能誘導(dǎo)BMSCs分化成Schwann細(xì)胞樣細(xì)胞，此模型可以用于BMSCs向Schwann細(xì)胞樣細(xì)胞分化的研究。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R741

【參考文獻(xiàn)】

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1 王紅;周曉巍;張宏;黃培堂;;鞘內(nèi)注射ω-芋螺毒素S03對(duì)大鼠慢性神經(jīng)痛的鎮(zhèn)痛作用及對(duì)DRG細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)含量的影響[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2006年06期

2 王燦;陳素;劉向明;;龍血素B抑制大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞辣椒素誘發(fā)的電流反應(yīng)[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2007年02期

3 勞杰,熊良儉,顧玉東,黃慧思;改良成年SD大鼠雪旺細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華手外科雜志;1999年02期

本文編號(hào)：2553083