【摘要】：肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種十分常見的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退行性疾病，家族遺傳性ALS(fALS)中約有20%是由SOD1基因的遺傳突變導(dǎo)致的，但其具體的致病機(jī)理尚未被闡明。銅鋅超氧化物歧化酶（Cu,ZnSOD）是生命體中主要的抗氧化酶，其功能是將O2-·自由基歧化成H2O2和O2，使細(xì)胞免受氧自由基的損傷。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明SOD1催化功能的喪失并非是fALS的致病原因，目前一個(gè)被普遍接受的發(fā)病機(jī)理的理論是SOD1的突變使其獲得了一種有毒的功能，該毒性引起神經(jīng)細(xì)胞的死亡，從而導(dǎo)致fALS病。但是這一理論的關(guān)鍵，也就是導(dǎo)致fALS病的SOD1突變使該酶獲得一種新的有毒功能，還沒有在實(shí)驗(yàn)上被直接證明。因此，對(duì)SOD1自身本來(lái)具有的或者突變后獲得的生物功能的研究無(wú)疑成為探究fALS致病機(jī)理的關(guān)鍵。 實(shí)驗(yàn)室前期工作中發(fā)現(xiàn)失去了Sod1活性的酵母細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出不耐高溫和鈣離子敏感的缺陷，而且敲除BSD2基因能使沒有Sod1酶的酵母細(xì)胞恢復(fù)耐高溫和鈣離子平衡。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，H+-ATP酶Pma1發(fā)生定位錯(cuò)誤時(shí)也會(huì)導(dǎo)致相同的缺陷，這些缺陷也同樣被BSD2的敲除而消除。因此，我們推斷Sod1在Pma1的正確定位過(guò)程中起重要作用，Pma1在沒有Sod1的細(xì)胞中發(fā)生了定位錯(cuò)誤，從而使細(xì)胞喪失耐高溫的能力和鈣離子失衡。本論文首先從實(shí)驗(yàn)上檢驗(yàn)了這一假設(shè)是否正確。 我們?cè)诮湍敢吧鷳B(tài)和sod1突變株細(xì)胞中表達(dá)了Pma1-GFP嵌合蛋白，借助激光共聚焦顯微鏡來(lái)觀察的Pma1的定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生態(tài)細(xì)胞的Pma1-GFP蛋白分子同文獻(xiàn)報(bào)道的一樣定位于細(xì)胞膜，而在sod1突變細(xì)胞中則分布在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)空間中。這一結(jié)果表明，Pma1在沒有Sod1的細(xì)胞中確實(shí)發(fā)生了定位錯(cuò)誤。此外，，我們還發(fā)現(xiàn)在sod1bsd2菌株中，Pma1和在野生態(tài)細(xì)胞中一樣正常定位在細(xì)胞膜上。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)了Sod1的一個(gè)以前未知的新生物功能，同時(shí)表明缺乏Sod1引起的Pma1的定位錯(cuò)誤很可能使酵母細(xì)胞喪失了耐高溫的能力和鈣離子失衡。 在獲得上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們研究了Pma1在SOD1G85R和SOD1G93A的酵母細(xì)胞中的定位。這兩個(gè)酵母細(xì)胞株表達(dá)類似于在人體中能導(dǎo)致fALS的Sod1的突變體G85R或者G93A。結(jié)果顯示，在SOD1G85R突變株中，30℃和39℃溫度下Pma1-GFP均錯(cuò)誤定位在了細(xì)胞質(zhì)中；而在SOD1G93A突變株中，在39℃時(shí)發(fā)生了定位錯(cuò)誤。更為重要的是，我們發(fā)現(xiàn)SOD1G85R細(xì)胞過(guò)度表達(dá)Pma1-GFP時(shí)發(fā)生了嚴(yán)重的細(xì)胞形態(tài)缺陷，而這個(gè)缺陷在過(guò)度表達(dá)Can1-GFP時(shí)顯得更為嚴(yán)重。同樣實(shí)驗(yàn)條件下，野生態(tài)和sod1細(xì)胞的形態(tài)都正常，沒有顯示變形。這是一個(gè)有重要意義的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)樗鞘状卧诮湍讣?xì)胞形態(tài)變化的水平上顯示與導(dǎo)致fALS病的相類似的G85R的Sod1突變確實(shí)獲得了一個(gè)新的有毒功能，而該功能使酵母細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的形態(tài)缺陷。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，酵母是研究fALS發(fā)病機(jī)理的一個(gè)很好的模型。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：TQ926;R744.8

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳淮楊，劉望夷;從超氧化物歧化酶的分布和結(jié)構(gòu)看其分子進(jìn)化[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1996年05期

本文編號(hào)：2550013