【摘要】：周圍神經(jīng)損傷，尤其是節(jié)段性缺損損傷，長久以來都是臨床醫(yī)生面臨的巨大挑戰(zhàn)。長節(jié)段缺損造成患區(qū)感覺運動功能缺失，且恢復(fù)緩慢，恢復(fù)效果不佳，是最為嚴(yán)重的創(chuàng)傷之一，致殘率高。目前，周圍神經(jīng)損傷修復(fù)方法雖已多種多樣，但仍以自體神經(jīng)移植作為“金標(biāo)準(zhǔn)”。除傳統(tǒng)的神經(jīng)斷端吻合、自體/異體神經(jīng)移植外，其他治療方法如新型神經(jīng)組織工程材料的開發(fā)與使用、種子細(xì)胞的培養(yǎng)與使用、神經(jīng)營養(yǎng)因子的復(fù)合使用、電刺激療法及新藥物的研制正被廣泛開發(fā)和研究。但是以上方法僅注意修復(fù)效果是否接近于自體神經(jīng)移植，卻忽略了神經(jīng)損傷瓦勒氏變性本身需要較長時間這一問題。因此，尋找一種既注重修復(fù)效果又能縮短治療時間的方法具有重要臨床意義。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗半乳糖神經(jīng)酰胺抗體和豚鼠補體聯(lián)用制備免疫性脫髓鞘劑可以促進擠壓傷和橫斷傷后周圍神經(jīng)修復(fù)和再生。但是，何種配比下能達(dá)到最好的脫髓鞘效果不得而知；再者，脫髓鞘劑作用的原理也不甚明了；第三，這種脫髓鞘劑能否促進長節(jié)段神經(jīng)缺損的恢復(fù)尚未研究。因此，本研究通過對脫髓鞘劑配比優(yōu)化、脫髓鞘劑有效性、細(xì)胞正負(fù)性作用和其對大鼠坐骨神經(jīng)15mm缺損自體神經(jīng)修復(fù)后神經(jīng)再生的促進作用進行了系統(tǒng)研究。以闡明脫髓鞘劑作用原理，評價其促神經(jīng)生長能力。主要分為四個部分進行研究： 第一部分免疫性脫髓鞘反應(yīng)藥物的配比優(yōu)化 目的：優(yōu)化脫髓鞘劑配比，證明脫髓鞘劑有效性。 方法：通過不同配比濃度的脫髓鞘劑對正常坐骨神經(jīng)作用進行比較，采用甲苯胺藍(lán)染色及透射電鏡的方法觀察實驗結(jié)果，并對實驗結(jié)果進行分析，篩選最優(yōu)方案。 結(jié)果：本實驗中發(fā)現(xiàn)4種配比的脫髓鞘劑對坐骨神經(jīng)的脫髓鞘作用均有效且并無明顯差別。甲苯胺藍(lán)染色和透射電鏡結(jié)果顯示4種脫髓鞘劑對神經(jīng)的作用表現(xiàn)相同趨勢。甲苯胺藍(lán)染色1d時顯示多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞腫脹、萎縮，排列稀疏，髓鞘邊緣出現(xiàn)不整，厚薄不均等情況；電鏡結(jié)果1d時顯示髓鞘普遍開始皺縮，板層結(jié)構(gòu)出現(xiàn)斷裂或顯示不清，部分神經(jīng)元開始萎縮變性。而1w時無論是甲苯胺藍(lán)染色還是透射電鏡結(jié)果均顯示正常神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)已大部分消失，僅殘留很少新生有髓神經(jīng)元。在電鏡圖片中對有髓神經(jīng)元數(shù)量進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)各配比間有髓神經(jīng)元數(shù)量無統(tǒng)計學(xué)差異（p0.05）。 結(jié)論：按抗Gal-C抗體/豚鼠補體原液絕對含量比=1:1的配比，配制步驟簡單，減少藥品污染和浪費，避免PBS溶液的干擾，優(yōu)化后續(xù)實驗分組，被認(rèn)為是最優(yōu)配比。并將此配比方案運用到后續(xù)實驗。 第二部分：免疫性脫髓鞘劑對神經(jīng)元及雪旺細(xì)胞的影響 目的：為驗證脫髓鞘劑本身對主要神經(jīng)元細(xì)胞和雪旺細(xì)胞的影響，以確定脫髓鞘劑的安全可靠性，并佐證了脫髓鞘劑促神經(jīng)生長的原理。 方法：利用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)較高純度背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和脊髓前角運動神經(jīng)元，并用常規(guī)方法培養(yǎng)高純度雪旺細(xì)胞。將脫髓鞘劑加入背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元、脊髓前角運動神經(jīng)元以及雪旺細(xì)胞中，通過免疫熒光染色和統(tǒng)計學(xué)分析觀察免疫性脫髓鞘劑對各種細(xì)胞的影響。 結(jié)果：通過以上方法培養(yǎng)出（93±5）%純度的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、（83±6）%純度的脊髓前角運動神經(jīng)元以及（92±2）%純度的雪旺細(xì)胞，滿足實驗要求。加入脫髓鞘劑后，免疫性脫髓鞘劑對上述三種細(xì)胞均無促進生長或增殖作用或毒性作用。其中檢測背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元加入脫髓鞘劑和去離子水對照組培養(yǎng)后軸突長度分別為827.6±23.1和835.9±22.8；脊髓運動神經(jīng)元加入脫髓鞘劑和去離子水對照組培養(yǎng)后軸突長度分別為374.6±24.7和377.2±26.1。雪旺細(xì)胞加入脫髓鞘劑和去離子水對照組培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)量分別為168537.3±12657.4和170519.1±13324.4。均無統(tǒng)計學(xué)差異（p0.05）。而利用活死細(xì)胞染色檢測各組細(xì)胞，僅出現(xiàn)極個別死亡細(xì)胞。但是脫髓鞘劑對雪旺細(xì)胞有改變形態(tài)的作用，由梭形變?yōu)槿切位蚨噙呅巍?結(jié)論：通過以上實驗結(jié)果可以看出，免疫性脫髓鞘劑對神經(jīng)元及雪旺細(xì)胞均無正性及負(fù)性作用，但是它會對雪旺細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，推測和它作用原理有關(guān)。 第三部分免疫性脫髓鞘藥物對大鼠長節(jié)段缺損的修復(fù)效果及機制的研究 目的：評價脫髓鞘劑單一組分對神經(jīng)的作用以及驗證免疫性脫髓鞘劑對長節(jié)段神經(jīng)缺損的促生長作用。進一步闡明脫髓鞘劑促進生長的原理。 方法：通過動物實驗、透射電鏡、免疫組織化學(xué)、逆行示蹤、RT-PCR、生物行為學(xué)等方法，從形態(tài)和功能綜合評價免疫性脫髓鞘劑的促神經(jīng)生長作用。并探索脫髓鞘劑促進神經(jīng)生長的機制。 結(jié)果：通過將脫髓鞘劑和各組分成分單一注射對比，證明了只有當(dāng)脫髓鞘劑兩種組分同時存在時，免疫性脫髓鞘反應(yīng)才會發(fā)生，單獨注射各個組分對神經(jīng)幾乎沒有影響。坐骨神經(jīng)指數(shù)分析方面可以看出，注射脫髓鞘劑組在各個時間點的數(shù)值優(yōu)于各對照組，說明其促進靶肌肉運動功能恢復(fù)的能力是肯定的。透射電鏡中分析神經(jīng)元數(shù)量、再生神經(jīng)面積、有髓神經(jīng)平均直徑及髓鞘化程度證明免疫性脫髓鞘劑在各個觀察時間點可以明顯促進神經(jīng)生長（p0.05）；熒光金逆行示蹤、肌肉HE染色和神經(jīng)免疫組化雙標(biāo)染色都顯示脫髓鞘劑在促神經(jīng)再生和功能恢復(fù)方面具有明顯的作用（p0.05）；RT-PCR反應(yīng)結(jié)果顯示免疫性脫髓鞘劑通過超敏反應(yīng)使周圍神經(jīng)發(fā)生脫髓脫失，提前瓦勒氏變性過程，闡明了免疫性脫髓鞘劑的作用原理和促神經(jīng)生長原理。 結(jié)論：綜上可以看出，免疫性脫髓鞘劑可以明顯通過提前瓦勒氏變性脫髓鞘其進程的作用來縮短神經(jīng)再生需要的時間，促進有利微環(huán)境的提早形成，促進神經(jīng)再生和患肢功能恢復(fù)。是一種全新理念的治療長節(jié)段缺損的新方法。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R745

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2534663