發(fā)布時(shí)間：2019-09-09 06:18

【摘要】：目的： 本實(shí)驗(yàn)擬研究硫化氫對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其與細(xì)胞自噬的關(guān)系，從而揭示其可能的作用機(jī)制。 方法： 實(shí)驗(yàn)分為正常對照組（Control組）、HR組、HR+10μM H2S組、HR+30μM H2S組，HR+60μM H2S組，HR+30μM H2S+LY294002（PI3K抑制劑）組。模擬體內(nèi)腦組織缺血再灌注損傷過程，分別對離體SH-SY5Y細(xì)胞和MACO法大鼠缺血再灌注模型腦組織進(jìn)行研究： 1、應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察各組SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的變化； 2、通過MTT法檢測各組SH-SY5Y細(xì)胞OD值，比較細(xì)胞存活率； 3、通過TTC染色比較大鼠腦組織梗死面積大�。� 4、應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測各組細(xì)胞自噬特異性標(biāo)記蛋白Beclin1、LC3B以及AKt蛋白表達(dá)水平的變化； 結(jié)果： 1、與Control組相比， HR組的SH-SY5Y細(xì)胞密度明顯稀疏（P0.05)。加入不同濃度H2S預(yù)處理后的SH-SY5Y細(xì)胞密度增加，細(xì)胞存活率在一定范圍內(nèi)與H2S劑量呈現(xiàn)劑量依賴性增加（P＜0.05），其中以60μM H2S的保護(hù)作用最明顯，與HR組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均0.05)；LY294002干預(yù)后30μM H2S組細(xì)胞密度減少，細(xì)胞存活率降低，與30μM H2S組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05)； 2、與Control組相比，HR組大鼠腦組織呈現(xiàn)明顯的腦梗死（P＜0.05），加入不同濃度H2S預(yù)處理后的大鼠腦組織梗死面積較�。≒＜0.05），梗死率在一定范圍內(nèi)與H2S劑量呈現(xiàn)劑量依賴性減小，其中以60μM H2S的保護(hù)作用最明顯，與HR組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均0.05)；LY294002干預(yù)后30μM H2S組大鼠腦組織梗死面積增大，梗死率升高，與30μM H2S組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05)； 3、在離體SH-SY5Y細(xì)胞和在體大鼠腦組織中，與Control組相比，HR組Beclin1表達(dá)水平均升高（P＜0.05），加入不同濃度H2S預(yù)處理后Beclin1表達(dá)水平減低（P＜0.05），在一定范圍內(nèi)與H2S劑量呈現(xiàn)劑量依賴性減小，其中以60μM H2S的作用最明顯，與HR組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均0.05)；LY294002干預(yù)后30μM H2S組Beclin1表達(dá)水平升高，與30μM H2S組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05)； 4、在離體SH-SY5Y細(xì)胞和在體大鼠腦組織中，與Control組相比，HR組LC3B表達(dá)水平均升高（P＜0.05），加入不同濃度H2S預(yù)處理后LC3B表達(dá)水平減低（P＜0.05），在一定范圍內(nèi)與H2S劑量呈現(xiàn)劑量依賴性減小，其中以60μM H2S的作用最明顯，與HR組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均0.05)；LY294002干預(yù)后30μM H2S組LC3B表達(dá)水平升高，與30μM H2S組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05)； 5、在離體SH-SY5Y細(xì)胞和在體大鼠腦組織中，，與Control組相比，HR組Akt蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著差別（P＞0.05），加入不同濃度H2S預(yù)處理后Akt蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），在一定范圍內(nèi)與H2S劑量呈現(xiàn)劑量依賴性升高，其中以60μM H2S的作用最明顯，與HR組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均0.05)；LY294002干預(yù)后30μM H2S組Akt蛋白表達(dá)水平降低，與30μM H2S組相比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05)。 結(jié)論： 1、外源性H2S能夠在離體水平和在體水平減輕腦缺血再灌注損傷，并且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性。 2、外源性H2S通過抑制細(xì)胞自噬減輕腦缺血再灌注損傷。 3、推測外源性H2S腦缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制可能是通過PI3K/Akt信號通路抑制細(xì)胞自噬作用來實(shí)現(xiàn)的。
【圖文】：

蛋白免疫印跡（Western Blot） 實(shí)驗(yàn)原理estern blot是通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測蛋白按分子量大小分離成條帶。通過一系列步驟，利用特異，最終使目的蛋白顯影。 實(shí)驗(yàn)步驟取蛋白樣品1）細(xì)胞蛋白提�。┪ヅ囵B(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用干凈的細(xì)胞刮養(yǎng)皿底刮下，4℃預(yù)冷的 PBS（pH7.4）沖洗轉(zhuǎn)移到 10

、不同濃度 H2S 對 SH-SY5Y 細(xì)胞的作用研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，如果設(shè)定正常細(xì)胞的存活率為 1，HR 組細(xì)胞明顯稀疏，存活率為 0.594，與正常對照組相比，具有顯著統(tǒng)計(jì)義（P＜0.05），加入不同濃度的 H2S 后各組細(xì)胞密度均增加， HR+10μM H2S 組細(xì)胞存活率為 0.687，HR+30μM H2S 組細(xì)胞存為 0.882，HR+60μM H2S 組細(xì)胞存活率為 0.932。不同濃度 H2S與正常對照組相比均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與 HR比均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，HR+30μM H2S 組R+60μM H2S 組與 HR+10μM H2S 組相比，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義0.05），HR+60μM H2S 組與 HR+30μM H2S 組相比，具有顯著統(tǒng)意義（P＜0.05）。見圖 4.1-4.2 和表 4.1。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R743.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2533421