【摘要】：目的： 本實驗擬研究硫化氫對腦缺血再灌注損傷的保護作用及其與細胞自噬的關(guān)系，從而揭示其可能的作用機制。 方法： 實驗分為正常對照組（Control組）、HR組、HR+10μM H2S組、HR+30μM H2S組，HR+60μM H2S組，HR+30μM H2S+LY294002（PI3K抑制劑）組。模擬體內(nèi)腦組織缺血再灌注損傷過程，分別對離體SH-SY5Y細胞和MACO法大鼠缺血再灌注模型腦組織進行研究： 1、應(yīng)用光學顯微鏡觀察各組SH-SY5Y細胞形態(tài)的變化； 2、通過MTT法檢測各組SH-SY5Y細胞OD值，比較細胞存活率； 3、通過TTC染色比較大鼠腦組織梗死面積大小； 4、應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測各組細胞自噬特異性標記蛋白Beclin1、LC3B以及AKt蛋白表達水平的變化； 結(jié)果： 1、與Control組相比， HR組的SH-SY5Y細胞密度明顯稀疏（P0.05)。加入不同濃度H2S預(yù)處理后的SH-SY5Y細胞密度增加，細胞存活率在一定范圍內(nèi)與H2S劑量呈現(xiàn)劑量依賴性增加（P＜0.05），其中以60μM H2S的保護作用最明顯，與HR組相比，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P均0.05)；LY294002干預(yù)后30μM H2S組細胞密度減少，細胞存活率降低，與30μM H2S組相比，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P0.05)； 2、與Control組相比，HR組大鼠腦組織呈現(xiàn)明顯的腦梗死（P＜0.05），加入不同濃度H2S預(yù)處理后的大鼠腦組織梗死面積較小（P＜0.05），梗死率在一定范圍內(nèi)與H2S劑量呈現(xiàn)劑量依賴性減小，其中以60μM H2S的保護作用最明顯，與HR組相比，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P均0.05)；LY294002干預(yù)后30μM H2S組大鼠腦組織梗死面積增大，梗死率升高，與30μM H2S組相比，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P0.05)； 3、在離體SH-SY5Y細胞和在體大鼠腦組織中，與Control組相比，HR組Beclin1表達水平均升高（P＜0.05），加入不同濃度H2S預(yù)處理后Beclin1表達水平減低（P＜0.05），在一定范圍內(nèi)與H2S劑量呈現(xiàn)劑量依賴性減小，其中以60μM H2S的作用最明顯，與HR組相比，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P均0.05)；LY294002干預(yù)后30μM H2S組Beclin1表達水平升高，與30μM H2S組相比，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P0.05)； 4、在離體SH-SY5Y細胞和在體大鼠腦組織中，與Control組相比，HR組LC3B表達水平均升高（P＜0.05），加入不同濃度H2S預(yù)處理后LC3B表達水平減低（P＜0.05），在一定范圍內(nèi)與H2S劑量呈現(xiàn)劑量依賴性減小，其中以60μM H2S的作用最明顯，與HR組相比，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P均0.05)；LY294002干預(yù)后30μM H2S組LC3B表達水平升高，與30μM H2S組相比，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P0.05)； 5、在離體SH-SY5Y細胞和在體大鼠腦組織中，，與Control組相比，HR組Akt蛋白表達水平?jīng)]有顯著差別（P＞0.05），加入不同濃度H2S預(yù)處理后Akt蛋白表達水平升高（P＜0.05），在一定范圍內(nèi)與H2S劑量呈現(xiàn)劑量依賴性升高，其中以60μM H2S的作用最明顯，與HR組相比，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P均0.05)；LY294002干預(yù)后30μM H2S組Akt蛋白表達水平降低，與30μM H2S組相比，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P0.05)。 結(jié)論： 1、外源性H2S能夠在離體水平和在體水平減輕腦缺血再灌注損傷，并且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性。 2、外源性H2S通過抑制細胞自噬減輕腦缺血再灌注損傷。 3、推測外源性H2S腦缺血再灌注損傷保護機制可能是通過PI3K/Akt信號通路抑制細胞自噬作用來實現(xiàn)的。
【圖文】：

蛋白免疫印跡（Western Blot） 實驗原理estern blot是通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測蛋白按分子量大小分離成條帶。通過一系列步驟，利用特異，最終使目的蛋白顯影。 實驗步驟取蛋白樣品1）細胞蛋白提�。┪ヅ囵B(yǎng)細胞的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用干凈的細胞刮養(yǎng)皿底刮下，4℃預(yù)冷的 PBS（pH7.4）沖洗轉(zhuǎn)移到 10

、不同濃度 H2S 對 SH-SY5Y 細胞的作用研究實驗結(jié)果表明，如果設(shè)定正常細胞的存活率為 1，HR 組細胞明顯稀疏，存活率為 0.594，與正常對照組相比，具有顯著統(tǒng)計義（P＜0.05），加入不同濃度的 H2S 后各組細胞密度均增加， HR+10μM H2S 組細胞存活率為 0.687，HR+30μM H2S 組細胞存為 0.882，HR+60μM H2S 組細胞存活率為 0.932。不同濃度 H2S與正常對照組相比均具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與 HR比均具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同時，HR+30μM H2S 組R+60μM H2S 組與 HR+10μM H2S 組相比，具有顯著統(tǒng)計學意義0.05），HR+60μM H2S 組與 HR+30μM H2S 組相比，具有顯著統(tǒng)意義（P＜0.05）。見圖 4.1-4.2 和表 4.1。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R743.3

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號：2533421