【摘要】：目的研究微小核糖核酸592(miR-592)對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株U251凋亡的影響。方法首先通過定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析miR-592在28份神經(jīng)膠質(zhì)瘤與其臨近癌旁組織中的表達水平;隨后向U251細胞轉(zhuǎn)染miR-592的擬合物,并通過流式細胞技術(shù)分析miR-592過表達對U251細胞凋亡的影響;通過生物信息學(xué)分析,找到miR-592的潛在靶分子,并通過熒光素酶雙報告實驗以及蛋白免疫印跡法等進行驗證;進一步,轉(zhuǎn)染U251細胞Runx2的下調(diào)siRNA,繪制細胞的生長曲線,并對U251細胞的凋亡進行分析。結(jié)果對28份神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和正常組織的定量PCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),miR-592在腫瘤組織中明顯低表達;miR-592過表達能明顯抑制U251細胞的生長;流式細胞分析結(jié)果顯示,miR-592顯著促進U251細胞凋亡:實驗對照組晚期凋亡率為7.2%±0.68%,而轉(zhuǎn)染miR-592組晚期凋亡率為17.47%±1.45%;熒光素酶雙報告實驗以及蛋白免疫印跡法實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-592直接靶向Runx2的3’-UTR來抑制Runx2蛋白的水平;接下來,向U251細胞轉(zhuǎn)染Runx2的siRNA,繪制細胞的生長曲線,并通過流式細胞技術(shù)分析U251細胞的凋亡率。結(jié)論 miR-592通過直接靶向Runx2來誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞凋亡,進而抑制腫瘤細胞的生長。
【圖文】：

A)。為了進一步研究miＲ-592是否在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著功能性的作用，我們合成了miＲ-592的mimics，并合成隨機序列的對照。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染U251細胞后，我們首先檢測了miＲ-592的表達(圖1B)，并通過MTT實驗繪制生長曲線(圖1C)。結(jié)果顯示，過表達miＲ-592能明顯抑制U251細胞生長。流式細胞實驗對U251細胞的凋亡檢測結(jié)果顯示miＲ-592能顯著性上調(diào)細胞凋亡率(圖1D，表1)。A:miＲ-592在腫瘤和癌旁組織中的表達;B:轉(zhuǎn)染mimics后miＲ-592的表達水平;C:MTT檢測U251細胞生長;D:流式細胞儀檢測miＲ-592過表達后U251細胞周期圖1miＲ-592促進U251細胞凋亡。Table1ApoptoticrateofU251cellsinvariousgroupsGroupEarlyapoptoticrate(%)Ｒepeat1Ｒepeat2Ｒepeat3x±sLateapoptoticrate(%)Ｒepeat1Ｒepeat2Ｒepeat3x±sNC13．712．9214．5213．71±0．87．876．517．217．2±0．68MiＲ-59212．811．3514．6612．94±1．661618．917．517．47±1．45＊＊＊＊P＜0．01，vsNCgroup·167·國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志2017年第44卷第2期

2．2Ｒunx2Ｒunx2是miＲ-592在U251細胞中的直接靶分子:為了進一步探究miＲ-592在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中的作用機制。通過查閱文獻我們發(fā)現(xiàn)Ｒunx2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中發(fā)揮著重要作用，，我們通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miＲ-592能直接靶向Ｒunx2的3’-UTＲ。熒光素酶雙報告實驗也顯示miＲ-592顯著性的抑制帶有Ｒunx2的3’-UTＲ的熒光素酶的活性(圖2A)。為了進一步驗證Ｒunx2是否是miＲ-592的直接靶分子，我們通過定量PCＲ的方法分析了Ｒunx2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織中的表達，結(jié)果顯示Ｒunx2的相對表達在腫瘤組織中明顯上調(diào)(圖2B)。隨后我們還通過westernblot的方法分析了轉(zhuǎn)染miＲ-592后U251細胞Ｒunx2蛋白的表達，結(jié)果顯示miＲ-592抑制Ｒunx2的蛋白水平(圖2C)。以上結(jié)果表明，Ｒunx2是miＲ-592在U251細胞中的直接靶分子。A:熒光素酶雙報告實驗;B:定量檢測Ｒunx2在腫瘤組織和癌旁組織中的表達;C:Ｒunx2在轉(zhuǎn)染miＲ-592和NC后U251細胞中的表達圖2Ｒunx2是miＲ-592在U251細胞中的直接靶蛋白2．3下調(diào)Ｒunx2表達水平抑制U251細胞生長并促進細胞凋亡為了研究Ｒunx2是否是miＲ-592在U251細胞中的功能性靶分子，我們設(shè)計了Ｒunx2下調(diào)的siＲ-NA。轉(zhuǎn)染U251細胞后，westernblot實驗驗證Ｒunx2的表達(圖3．A)。同時，我們也檢測了下調(diào)Ｒunx2對U251細胞生長的影響，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了Ｒunx2siＲNA的細胞生長明顯比對照組低(圖3．B)。流式細胞技術(shù)對周期的檢測顯示，Ｒunx2下調(diào)表達上調(diào)U251細胞的凋亡率(圖3．C和Table2)。綜上所述，下調(diào)Ｒunx2表達能重現(xiàn)miＲ-592過表達的表型，說明Ｒunx2是miＲ-592的功能性靶分子。A:westernblot驗證siＲNA下調(diào)效率;B:MTT實驗檢測Ｒunx2下調(diào)后細胞生長情況;C:流式細胞儀分析Ｒunx2下調(diào)后細胞凋亡率圖3下調(diào)Ｒunx2
【作者單位】： 濱州市中心醫(yī)院腫瘤科;新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒外一科;
【分類號】：R739.4

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本文編號：2531977