【摘要】：目的研究微小核糖核酸592(miR-592)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251凋亡的影響。方法首先通過定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析miR-592在28份神經(jīng)膠質(zhì)瘤與其臨近癌旁組織中的表達(dá)水平;隨后向U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-592的擬合物,并通過流式細(xì)胞技術(shù)分析miR-592過表達(dá)對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響;通過生物信息學(xué)分析,找到miR-592的潛在靶分子,并通過熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)以及蛋白免疫印跡法等進(jìn)行驗(yàn)證;進(jìn)一步,轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞Runx2的下調(diào)siRNA,繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,并對(duì)U251細(xì)胞的凋亡進(jìn)行分析。結(jié)果對(duì)28份神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和正常組織的定量PCR結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),miR-592在腫瘤組織中明顯低表達(dá);miR-592過表達(dá)能明顯抑制U251細(xì)胞的生長(zhǎng);流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示,miR-592顯著促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡:實(shí)驗(yàn)對(duì)照組晚期凋亡率為7.2%±0.68%,而轉(zhuǎn)染miR-592組晚期凋亡率為17.47%±1.45%;熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)以及蛋白免疫印跡法實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-592直接靶向Runx2的3’-UTR來抑制Runx2蛋白的水平;接下來,向U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染Runx2的siRNA,繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,并通過流式細(xì)胞技術(shù)分析U251細(xì)胞的凋亡率。結(jié)論 miR-592通過直接靶向Runx2來誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
【圖文】：

A)。為了進(jìn)一步研究miＲ-592是否在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著功能性的作用，我們合成了miＲ-592的mimics，并合成隨機(jī)序列的對(duì)照。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后，我們首先檢測(cè)了miＲ-592的表達(dá)(圖1B)，并通過MTT實(shí)驗(yàn)繪制生長(zhǎng)曲線(圖1C)。結(jié)果顯示，過表達(dá)miＲ-592能明顯抑制U251細(xì)胞生長(zhǎng)。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)U251細(xì)胞的凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示miＲ-592能顯著性上調(diào)細(xì)胞凋亡率(圖1D，表1)。A:miＲ-592在腫瘤和癌旁組織中的表達(dá);B:轉(zhuǎn)染mimics后miＲ-592的表達(dá)水平;C:MTT檢測(cè)U251細(xì)胞生長(zhǎng);D:流式細(xì)胞儀檢測(cè)miＲ-592過表達(dá)后U251細(xì)胞周期圖1miＲ-592促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡。Table1ApoptoticrateofU251cellsinvariousgroupsGroupEarlyapoptoticrate(%)Ｒepeat1Ｒepeat2Ｒepeat3x±sLateapoptoticrate(%)Ｒepeat1Ｒepeat2Ｒepeat3x±sNC13．712．9214．5213．71±0．87．876．517．217．2±0．68MiＲ-59212．811．3514．6612．94±1．661618．917．517．47±1．45＊＊＊＊P＜0．01，vsNCgroup·167·國(guó)際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志2017年第44卷第2期

2．2Ｒunx2Ｒunx2是miＲ-592在U251細(xì)胞中的直接靶分子:為了進(jìn)一步探究miＲ-592在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制。通過查閱文獻(xiàn)我們發(fā)現(xiàn)Ｒunx2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用，，我們通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miＲ-592能直接靶向Ｒunx2的3’-UTＲ。熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn)也顯示miＲ-592顯著性的抑制帶有Ｒunx2的3’-UTＲ的熒光素酶的活性(圖2A)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Ｒunx2是否是miＲ-592的直接靶分子，我們通過定量PCＲ的方法分析了Ｒunx2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示Ｒunx2的相對(duì)表達(dá)在腫瘤組織中明顯上調(diào)(圖2B)。隨后我們還通過westernblot的方法分析了轉(zhuǎn)染miＲ-592后U251細(xì)胞Ｒunx2蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示miＲ-592抑制Ｒunx2的蛋白水平(圖2C)。以上結(jié)果表明，Ｒunx2是miＲ-592在U251細(xì)胞中的直接靶分子。A:熒光素酶雙報(bào)告實(shí)驗(yàn);B:定量檢測(cè)Ｒunx2在腫瘤組織和癌旁組織中的表達(dá);C:Ｒunx2在轉(zhuǎn)染miＲ-592和NC后U251細(xì)胞中的表達(dá)圖2Ｒunx2是miＲ-592在U251細(xì)胞中的直接靶蛋白2．3下調(diào)Ｒunx2表達(dá)水平抑制U251細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)細(xì)胞凋亡為了研究Ｒunx2是否是miＲ-592在U251細(xì)胞中的功能性靶分子，我們?cè)O(shè)計(jì)了Ｒunx2下調(diào)的siＲ-NA。轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后，westernblot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Ｒunx2的表達(dá)(圖3．A)。同時(shí)，我們也檢測(cè)了下調(diào)Ｒunx2對(duì)U251細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了Ｒunx2siＲNA的細(xì)胞生長(zhǎng)明顯比對(duì)照組低(圖3．B)。流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)周期的檢測(cè)顯示，Ｒunx2下調(diào)表達(dá)上調(diào)U251細(xì)胞的凋亡率(圖3．C和Table2)。綜上所述，下調(diào)Ｒunx2表達(dá)能重現(xiàn)miＲ-592過表達(dá)的表型，說明Ｒunx2是miＲ-592的功能性靶分子。A:westernblot驗(yàn)證siＲNA下調(diào)效率;B:MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ｒunx2下調(diào)后細(xì)胞生長(zhǎng)情況;C:流式細(xì)胞儀分析Ｒunx2下調(diào)后細(xì)胞凋亡率圖3下調(diào)Ｒunx2
【作者單位】： 濱州市中心醫(yī)院腫瘤科;新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒外一科;
【分類號(hào)】：R739.4

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本文編號(hào)：2531977