發(fā)布時(shí)間：2019-09-03 17:01

【摘要】：目的神經(jīng)退行性疾病是一類以中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元進(jìn)行性損傷及死亡導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)功能障礙和認(rèn)知功能受損為特征的一類疾病。神經(jīng)退行性疾病已成為第四位死亡原因。帕金森氏病(Parkinson's Disease, PD)作為常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病之一已在世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響人類的健康及經(jīng)濟(jì)狀況。雖然針對(duì)PD的基礎(chǔ)研究及臨床實(shí)驗(yàn)眾多,但其發(fā)病機(jī)制至今未明。近年線粒體功能障礙導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡被不斷發(fā)現(xiàn)在PD病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用,特別與家族性常染色體隱性遺傳的早發(fā)性帕金森氏病(autosomal recessive early-onset Parkinson's disease)關(guān)系密切。Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10 (PTEN)-induced putative kinase 1 (PINK1)基因?yàn)镻D相關(guān)基因,在線粒體的質(zhì)量控制方面發(fā)揮重要功能,如識(shí)別功能受損的線粒體并介導(dǎo)其降解。PINK1功能障礙導(dǎo)致線粒體異常堆積、多巴胺能神經(jīng)元死亡等多種PD特征性病理改變。前期研究表明轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NFκB參與調(diào)節(jié)UCHL1, USP24和RNF11等PD相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),在PD的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究在前期研究基礎(chǔ)上以人類PINK1基因?yàn)檠芯繉?duì)象,研究轉(zhuǎn)錄因子NFκB對(duì)PINK1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其分子機(jī)制。材料和方法1.用5’端-末端快速擴(kuò)增技術(shù)(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)中的基于模板跳轉(zhuǎn)的反轉(zhuǎn)錄(Switching Mechanism At 5'End of RNA Transcript, SMART) RACE技術(shù)檢測(cè)PINK1基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Transcription Start Site, TSS)。2.根據(jù)TSS結(jié)果克隆人類PINK1基因啟動(dòng)子不同區(qū)域序列驅(qū)動(dòng)的重組熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,用雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告分析系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay system)檢測(cè)不同重組質(zhì)粒的熒光活性從而評(píng)估啟動(dòng)子活性,通過(guò)啟動(dòng)子缺失分析(deletion analysis),找出核心啟動(dòng)子區(qū)(core promoter)。3.利用Genomatix及TFSearch在線軟件分析人類PINK1基因功能啟動(dòng)子區(qū)可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子(Transcription Factor, TF)。根據(jù)結(jié)合參數(shù)進(jìn)行篩選分析。合成轉(zhuǎn)錄因子NFκB結(jié)合位點(diǎn)寡聚核苷酸探針及PINK1基因中可能結(jié)合NFκB的寡聚核苷酸序列,提取過(guò)表達(dá)NFκBp65的核蛋白,采用電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)對(duì)預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子NFκB結(jié)合位點(diǎn)的有效性進(jìn)行驗(yàn)證。4.在不同細(xì)胞系(HEK293, SH-SY5Y, N2a)共轉(zhuǎn)染NFκB p65的表達(dá)質(zhì)粒pMTF-NFκB p65及含有PINK1功能啟動(dòng)子的重組熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pPINK1-A,采用Luciferase assay技術(shù)研究高表達(dá)NFκB p65蛋白對(duì)PINK1啟動(dòng)子活性影響。5.在HEK293細(xì)胞中高表達(dá)NFκB p65蛋白,分別用半定量反轉(zhuǎn)錄PCR (semi-quantitative reverse transcription-PCR, rt-PCR)及蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blot, WB)檢測(cè)NFκB p65對(duì)人類PINK1基因在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平的影響。同時(shí)在SH-SY5Y細(xì)胞中高表達(dá)NFκB p65蛋白或誘導(dǎo)內(nèi)源性NFκB活化,用WB檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NFκB對(duì)PINK1基因在翻譯水平的調(diào)控。結(jié)果1.用SMART-RACE方法和基因特異性擴(kuò)增技術(shù)獲得長(zhǎng)約650bp長(zhǎng)核酸片段,將其克隆進(jìn)pcDNA4/myc-His載體,測(cè)序分析結(jié)果顯示與外源SMARTer ⅡA Oligonucleotide相接的首個(gè)堿基為PINK1基因翻譯起始位點(diǎn)(Translational Start Site, ATG)上游91bp處的腺嘌呤A(Adenine)。2.擴(kuò)增PINK1基因啟動(dòng)子區(qū)-1799至+26共1825bp區(qū)域內(nèi)不同長(zhǎng)度序列,所有片段構(gòu)建入載體pGL3-basic形成重組熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pPINK1-A至pPINK1-I共9個(gè)。熒光活性檢測(cè)結(jié)果顯示pPINK1-A的相對(duì)熒光素酶活性為(113.47±10.63 RLU)。刪減分析結(jié)果顯示pPINK1-G的相對(duì)熒光素酶活性為(78.44±4.74 RLU),進(jìn)一步刪減所得質(zhì)粒pPINK1-H的相對(duì)熒光活性明顯降低。3.以在線軟件Genomatix及TFSearch為工具對(duì)PINK1基因啟動(dòng)子區(qū)-1799至+1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)分析,以結(jié)合系數(shù)90%為閾值進(jìn)行篩選,結(jié)果顯示人類PINK1基因啟動(dòng)子區(qū)含有AP1, MEF, cAMP-反應(yīng)原件等,并含有4個(gè)NFκB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分別命名為PINK1-NFκB-1/2/3/4。EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NFκB p65蛋白主要與PINK1-NFκB-1寡聚核苷酸產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。4.在HEK293, SH-SY5Y及N2a三細(xì)胞系共轉(zhuǎn)pMTF-NFκB p65質(zhì)粒及pPINKl-A質(zhì)粒,結(jié)果顯示人類PINK1基因啟動(dòng)子活性在NFκBp65過(guò)表達(dá)情況下分別提高了3.43±0.55、2.11±0.10、1.63±0.01倍(P0.01)。5.在HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pMTF-NFκB p65質(zhì)粒,rt-PCR結(jié)果顯示相較于空質(zhì)粒pMTF,轉(zhuǎn)染pMTF-NFκB p65質(zhì)粒細(xì)胞的內(nèi)源性PINK1 mRNA水平升高了59.51%±15.13%(p0.01),WB顯示全長(zhǎng)PINK1 (FL-PINK1)蛋白表達(dá)強(qiáng)度增加至214.53%±38%(P0.01)。在SH-SY5Y細(xì)胞中,NFκB p65蛋白過(guò)表達(dá)使三種不同分子量的PINK1相關(guān)蛋白(FL-PINK1,Δ1-PINK1,Δ2-PINK1)表達(dá)分別增加45.26%±19.58%,41.10±6.70%及48.54±4.50%(p0.01)。用LPS以25ng/ml濃度處理SH-SY5Y細(xì)胞16小時(shí)后,FL-PINK1,Δ1-PINK1及A2-PINK1表達(dá)分別增加了26.77%±2.33%,24.46土2.59%及83.57±4.60%p0.001)。結(jié)論1.人類PINK1基因主要的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為其翻譯起始位點(diǎn)ATG上游91bp處的腺嘌呤A。2.人類PINK1基因-1799至+26片段具有顯著啟動(dòng)子活性,為PINK1基因功能啟動(dòng)子區(qū)；啟動(dòng)子區(qū)-78+26片段為PINK1基因啟動(dòng)子最短核心功能區(qū)。3.人類PINK1基因有復(fù)雜精確的調(diào)控機(jī)制,NFκB能與其啟動(dòng)子區(qū)有效結(jié)合。4.轉(zhuǎn)錄因子NFκB能夠提高人類PINK1基因的啟動(dòng)子活性。5.轉(zhuǎn)錄因子NFκB上調(diào)人類PINK1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。
【圖文】：

邐重慶醫(yī)科大學(xué)博±研巧生學(xué)位論文邐逡逑化，ＩｋＢｃｘ被y酸化從ＩｋＢ－ＮＦｋＢ復(fù)合體中脫離并迅速降解，暴露ＮＦｋＢ核定位位逡逑點(diǎn)，游離的ＮＦｋＢ邋＾聚體活化并化速進(jìn)入細(xì)胞核（％），與目的基肉的ＤＮＡ序列產(chǎn)逡逑生特異性結(jié)合，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄表達(dá)（５７，邋５８）。逡逑

氧化壓力及自由氧離子作為ＮＦｋＢ活化的誘導(dǎo)因子，在ＰＤ病理改變中亦扮演逡逑了重要角色，有研究顯示在ＰＤ動(dòng)物模型及ＰＤ病人腦中，多己胺能神經(jīng)元內(nèi)ＮＦｋＢ逡逑的激活及核肉轉(zhuǎn)移明雖增多（６０－６２）。我們之前己發(fā)現(xiàn)并報(bào)導(dǎo)ＮＦｋＢ作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)逡逑因子參與調(diào)節(jié)ＰＤ相關(guān)基因ＵＣＨＬ１（６３）及ＵＳＰ２４（６４）的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，且有研巧發(fā)現(xiàn)逡逑ＮＦｋＢ和ＰＤ另一相關(guān)基因ＲＮＦ１１邋（６５）的表達(dá)水平密切相關(guān)，，說(shuō)明ＮＦｋＢ在ＰＤ的逡逑發(fā)病過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。逡逑本研巧的目的逡逑盡管ＰＩＮＫ１在維持線粒體正常質(zhì)量方面的功能己被廣泛研究，但調(diào)節(jié)ＰＩＮＫ１逡逑基因表達(dá)的研巧甚少。本研究的目的為研究人類ＰＩＮＫ１基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，從而逡逑進(jìn)一步理解ＰＤ發(fā)病的基礎(chǔ)機(jī)制。逡逑１９逡逑
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R742.5

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 任紅;細(xì)胞凋亡的基因調(diào)節(jié)[J];中華肝臟病雜志;1996年02期

2 顧朱勤;陳彪;;吸煙相關(guān)基因的研究進(jìn)展[J];中國(guó)行為醫(yī)學(xué)科學(xué);2006年06期

3 陳青;董堅(jiān);;細(xì)胞穿透肽在基因調(diào)節(jié)中的應(yīng)用[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2012年18期

4 趙貴英;張樹(shù)庸;;基因科學(xué)研究動(dòng)態(tài)[J];中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù);2012年04期

5 ;《基因組研究》:大腦衰老或與基因調(diào)節(jié)失控有關(guān)[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年20期

6 奇云;;基因決定細(xì)胞生死[J];生活與健康;2002年12期

7 路敦躍;早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因egr-1研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));1997年03期

8 盧偉成;;腫瘤細(xì)胞的基因調(diào)節(jié)和基因治療[J];浙江腫瘤通訊;1978年02期

9 張子金;胚胎發(fā)育過(guò)程中基因的調(diào)節(jié)與控制[J];甘肅科技;2005年07期

10 曾嶸;c-myc的基因調(diào)節(jié)作用[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊(cè);1997年02期

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 本報(bào)記者 顧泳;基因診病：夢(mèng)想很美路還很長(zhǎng)[N];解放日?qǐng)?bào);2013年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 王溫琴;時(shí)滯基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性研究[D];電子科技大學(xué);2014年

2 段曉玲;NFκB上調(diào)PINK1基因的表達(dá)及其分子機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2014年

3 張偉光;沈陽(yáng)地區(qū)健康人群四個(gè)衰老相關(guān)基因的遺傳學(xué)研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2010年

4 李明才;人IL-28和IL-29基因的克隆與表達(dá)[D];汕頭大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 程方方;陽(yáng)城多目渦蟲(chóng)頭部再生過(guò)程中相關(guān)基因的克隆及表達(dá)分析[D];河南師范大學(xué);2013年

2 劉香娟;非p53依賴通路c-myc基因調(diào)控p14~(ARF)基因表達(dá)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究[D];青島大學(xué);2012年

3 張傳倉(cāng);脆性X智力低下一號(hào)基因與環(huán)腺苷一磷酸相互調(diào)節(jié)作用的研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2002年

4 徐麗娟;人乳頭瘤病毒16 E7基因在大腸桿菌中的克隆和表達(dá)[D];吉林大學(xué);2010年

5 羅紅;人Tum-5基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的建立與分析[D];北華大學(xué);2008年

6 劉相萍;發(fā)育調(diào)控基因Pax2的克隆化及重組Pax2的真核表達(dá)[D];青島大學(xué);2004年

7 馬兆武;γ-氨基丁酸對(duì)煙草乙烯合成基因及乙烯信號(hào)組分基因表達(dá)的調(diào)節(jié)[D];中南民族大學(xué);2009年

8 曲曉娟;東亞三角渦蟲(chóng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及DjGon基因的進(jìn)化、表達(dá)分析[D];山東理工大學(xué);2008年

9 晏澤輝;利用PolⅡ-ChIP技術(shù)鑒定肝病關(guān)聯(lián)基因ESR1/CXCL10 rSNP的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2006年

10 薛紅;HMT家族新成員SET07生化特性及功能研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

本文編號(hào)：2531478