【摘要】：DJ-1/PARK7（Parkinson protein7）基因的缺失或突變，是引起的常染色體隱性早發(fā)性帕金森�。≒arkinson's disease，PD）一個重要的原因。然而，DJ-1突變體誘發(fā)帕金森病的原因仍未被人們了解。β-Syn突變在細胞內(nèi)形成包涵體，加速神經(jīng)細胞退化。在誘導細胞變性的過程中DJ-1與β-Syn突變體之間的聯(lián)系與自噬關(guān)系還不清楚。所以我們的研究旨在穩(wěn)定表達β-Syn P123H的239T細胞中研究P123H與DJ-1突變體的相互作用以及對神經(jīng)退化的影響。 本實驗首先通過PCR構(gòu)建DJ-1野生型（DJ-1WT）與兩步PCR構(gòu)建突變體的方法構(gòu)建L166P、D149A、A104T三個突變型的真核表達質(zhì)粒，通過質(zhì)粒全長測序確定序列的正確性。使用帶有潮霉素抗性標記的β-Syn P123H質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細胞，使用推薦劑量200μg/mL的Hygromycin B（潮霉素B）建立抗性篩選的β-Syn P123H穩(wěn)定表達293T細胞模型。并在建立的β-Syn P123H突觸核蛋白細胞的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染DJ-1野生型與DJ-1突變型質(zhì)粒。 其次，為確定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的表達情況，使用免疫印跡以及免疫熒光標記，分別檢測DJ-1的標簽蛋白C-Myc與β-Syn P123H，使用Real-time PCR檢測293T細胞模型內(nèi)DJ-1與β-Syn mRNA的水平，確定細胞模型構(gòu)建成功。 通過對線粒體的熒光標記，加入FCCP帶來氧化應(yīng)激的刺激，測定細胞模型線粒體對于氧化應(yīng)激的應(yīng)答水平。通過細胞的WST-1活性分析，乳酸脫氫酶（LDH）的釋放測定細胞模型的活性，檢測DJ-1與β-Syn P123H對于細胞的毒性影響。 最后通過溶酶體的標記Marker測定β-Syn P123H與DJ-1和溶酶體的關(guān)系。研究Atg-5、Becline-1、LC3三種哺乳動物的自噬相關(guān)基因的表達情況。檢測mTOR通路上的mTOR、p70-S6K、4E-BP1的磷酸化水平。使用自噬溶酶體和蛋白酶體的抑制劑確定β-Syn P123H以及重組的DJ-1蛋白的降解途徑以及作用方式。通過TUNEL測定β-SynP123H細胞的凋亡水平。 結(jié)論：穩(wěn)定高表達β-Syn P123H蛋白在細胞內(nèi)聚集，通過自噬溶酶體途徑降解。β-SynP123H與FCCP一樣對線粒體產(chǎn)生去極化，DJ-1WT可以挽救線粒體去極化現(xiàn)象，緩解β-Syn P123H的細胞毒性，而DJ-1突變體則加重細胞毒性。野生型的DJ-1彌散分布在細胞內(nèi)，通過自噬溶酶體途徑與β-Syn P123H產(chǎn)生相互作用，促進β-Syn P123H降解。突變DJ-1在線粒體聚集，誘導蛋白自噬障礙，β-Syn P123H在胞內(nèi)聚集增多加速神經(jīng)退化和自噬性細胞死亡。
【圖文】：

4 結(jié)果與討論構(gòu)建、鑒定以及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系in 重組質(zhì)粒構(gòu)建生型 DJ-1 WT 與 DJ-1 突變體的全A 作為重組質(zhì)粒的骨架，使用 T4 連49A、DJ-1A104T 全長于 Hind III 與 C-Myc 與 6×His 的標簽，原核篩選抗e（Neo），，重組質(zhì)粒在 E.coil 大腸桿篩選出含有重組質(zhì)粒的陽性大腸桿菌Marker 1 2 3 4Marker

圖 4-2：DJ-1 重組質(zhì)粒測序圖譜突變位點與野生型對照，L166P中CCT 亮氨酸突變?yōu)镃CT 脯氨酸，D149A中GAC 丙氨酸，A104T 中 GCC 丙氨酸變?yōu)?ACC 蘇氨酸）圖 4-3：DJ-1，α-Syn WT，β-Syn WT 與 β-Syn P123H 質(zhì)粒主要結(jié)構(gòu)基因連接在 pcDNA3.1(-)/myc-HisA 質(zhì)粒, Synuclein 連接在 pCEP4 質(zhì)粒）為 DJ-1 突變體與野生型序列的測序?qū)Ρ惹闆r，方框內(nèi)的基因位點經(jīng)過
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R742.5

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 馮婭;吳云成;;線粒體功能異常在帕金森病發(fā)病機制中的研究進展[J];國際神經(jīng)病學神經(jīng)外科學雜志;2014年04期

2 魏婕;范剛啟;;針刺治療帕金森病作用機制研究進展[J];遼寧中醫(yī)藥大學學報;2014年04期

3 蔡颯;陳應(yīng)城;岑國欣;;誘導性多能干細胞與神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型的構(gòu)建(英文)[J];生理學報;2014年01期

4 吳珍;張亞;貝云成;沈萍萍;;微囊藻毒素-LR對小鼠肝細胞線粒體功能的影響[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2014年02期

5 紀元;龍建綱;劉健康;;自噬發(fā)生中的ROS調(diào)節(jié)機制[J];中國生物化學與分子生物學報;2014年04期

6 Baogang Wang;Qingsan Zhu;Xiaxia Man;Li Guo;Liming Hao;;Ginsenoside Rd inhibits apoptosis following spinal cord ischemia/reperfusion injury[J];Neural Regeneration Research;2014年18期

7 Paolina Pantcheva;Maya Elias;Kelsey Duncan;Cesar V.Borlongan;Naoki Tajiri;Yuji Kaneko;;The role of DJ-1 in the oxidative stress cell death cascade after stroke[J];Neural Regeneration Research;2014年15期

8 Wilhelmus J Kwanten;Wim Martinet;Peter P Michielsen;Sven M Francque;;Role of autophagy in the pathophysiology of nonalcoholic fatty liver disease:A controversial issue[J];World Journal of Gastroenterology;2014年23期

9 肖仲清;龍生根;朱其舟;嚴金金;梅彤;舒寬勇;;沉默DJ-1基因表達對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞增殖及凋亡的影響[J];腫瘤;2014年10期

10 程艷偉;靳夢醒;閆海;黃大可;黃保軍;張林杰;;脂多糖誘導小鼠腹腔巨噬細胞parkin表達及線粒體自噬形成[J];中國免疫學雜志;2014年11期

相關(guān)博士學位論文 前7條

1 孔濱;RNA干擾GCase對α-突觸核蛋白的影響及其機制的初步研究[D];第三軍醫(yī)大學;2013年

2 張學偉;MicroRNAs對帕金森病致病基因LRRK2表達調(diào)控機制研究[D];中南大學;2011年

3 高立;神經(jīng)生長因子MEF2D氧化修飾及降解在帕金森發(fā)病機制中的作用[D];第四軍醫(yī)大學;2013年

4 王陽;膿毒癥相關(guān)性腦病星形膠質(zhì)細胞線粒體生物發(fā)生實驗研究[D];南方醫(yī)科大學;2014年

5 劉瑋;Vps35在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞變性中的作用研究[D];第三軍醫(yī)大學;2014年

6 曹戟;活性氧簇（ROS）介導的蛋白翻譯后修飾調(diào)控腫瘤細胞死亡的作用及其機制研究[D];浙江大學;2013年

7 鐘永軍;低溫培養(yǎng)增加畢赤酵母的外源蛋白產(chǎn)量的機制研究[D];中國科學技術(shù)大學;2014年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 王莎莎;替米沙坦對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟及大網(wǎng)膜組織中抵抗素表達的影響[D];河北醫(yī)科大學;2013年

2 程潔;氯化鈰對肝臟及免疫功能的影響及分子機制研究[D];蘇州大學;2013年

3 韓海燕;散發(fā)性帕金森病microRNA表達譜研究和靶基因預測[D];華中科技大學;2013年

4 孫情情;納米氧化鈦長期暴露小鼠致肺毒性及其分子機制的研究[D];蘇州大學;2014年

5 桂素馨;納米氧化鈦導致小鼠腎損傷的分子機制研究[D];蘇州大學;2014年

6 陳云龍;大黃素在鼻咽癌CNE-1細胞的藥代動力學研究[D];廣西醫(yī)科大學;2014年

7 章龍玉;自噬基因LC-3與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性研究[D];安徽醫(yī)科大學;2014年

8 劉琛;帕金森病患者合并糖尿病的非運動癥狀特征分析[D];山東大學;2014年

9 李艷;高糖、高同型半胱氨酸環(huán)境對足細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78及CHOP表達的影響[D];山西醫(yī)科大學;2014年

10 常麗俊;納米氧化鋁致神經(jīng)元細胞線粒體自噬的研究[D];山西醫(yī)科大學;2014年

本文編號：2516705