【摘要】：背景 腦水腫不僅可以導致腦細胞功能障礙，而且可造成顱內(nèi)高壓，影響腦的血液灌流，甚至形成腦疝而致病人死亡。腦水腫的發(fā)生與腦內(nèi)水轉(zhuǎn)運異常有關。水通道蛋白-4（aquaporin-4,AQP4）是一種水轉(zhuǎn)運蛋白，它在腦內(nèi)呈極性分布于膠質(zhì)細胞膜上，包括星形膠質(zhì)細胞在微血管周圍形成的細胞足突，軟腦膜內(nèi)表面形成的膠質(zhì)界膜和室管膜細胞的基底膜等部位。這些部位都是腦實質(zhì)與腦血管或腦脊液相交界的部位，提示AQP4的這種極性分布形式在腦實質(zhì)與腦血管/腦脊液的水轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用。 腦水腫主要有細胞毒性和血管源性兩種類型，細胞毒性腦水腫的形態(tài)學特點主要表現(xiàn)為水分在細胞內(nèi)滯留，細胞腫脹，但血腦屏障保持完整；而血管源性腦水腫則表現(xiàn)為水分在細胞間聚集，細胞間隙增大，血腦屏障破壞。AQP4在不同類型腦水腫中的作用不同。AQP4表達增加可促進經(jīng)AQP4轉(zhuǎn)運進入細胞內(nèi)的水分，從而加重細胞毒性水腫；而AQP4表達增加卻有利于細胞間隙多余水分的清除，從而減輕血管源性水腫。因此，對于不同類型的腦水腫，針對AQP4有不同的治療策略：抑制AQP4的水轉(zhuǎn)運功能有利于減輕細胞毒性水腫；而促進AQP4的水轉(zhuǎn)運功能有利于減輕血管源性腦水腫。 在腦缺血、癲癇和顱內(nèi)腫瘤等多種疾病造成腦水腫的動物和患者腦內(nèi)，AQP4的蛋白表達水平和極性分布形式發(fā)生改變，但是其機制仍不明確。 有資料顯示，，包括AQP4在內(nèi)的部分膜蛋白可以從細胞膜內(nèi)化（internalization）至細胞內(nèi)，同時伴隨其水轉(zhuǎn)運功能的改變。內(nèi)化進入細胞內(nèi)的膜蛋白可被分選（sorting）至溶酶體，被水解酶降解。腦內(nèi)疾病所致的AQP4極性分布的改變是否與其內(nèi)化和分選過程有關，目前未見報道。 如果證實在腦水腫的發(fā)生過程中存在AQP4內(nèi)化和溶酶體分選的現(xiàn)象，將為針對AQP4對腦水腫進行治療的策略提供新思路。促進AQP4的內(nèi)化和溶酶體降解，以減少在細胞膜上發(fā)揮水轉(zhuǎn)運功能的AQP4，進而減少通過AQP4進入細胞內(nèi)的水分，將有利于減輕細胞毒性腦水腫；而抑制AQP4的內(nèi)化和溶酶體降解將使AQP4仍呈極性分布于膠質(zhì)細胞膜上，有利于促進細胞間隙中多余水分的清除以減輕血管源性腦水腫。 目的 在大鼠腦缺血和細菌性腦膜炎這兩種模型中，研究在腦水腫的發(fā)生發(fā)展過程中，是否存在AQP4內(nèi)化和溶酶體分選的現(xiàn)象并對其機制進行初步探討。 內(nèi)容和方法 本研究包括兩部分：第一部分，研究在大鼠缺血性腦水腫模型中是否存在AQP4內(nèi)化和溶酶體分選，并對其機制進行初步探討；第二部分，研究在大鼠腦膜炎腦水腫模型中是否存在AQP4內(nèi)化和溶酶體分選。 第一部分 ⑴研究在大鼠缺血性腦水腫模型中是否存在AQP4內(nèi)化和溶酶體分選： 用線栓法制作大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）的大鼠腦缺血模型；采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride, TTC）染色方法觀察腦內(nèi)缺血的部位和程度；采用透射電鏡觀察腦缺血早期腦內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，以明確腦水腫的類型；運用免疫熒光雙標的方法檢測AQP4分別與早期內(nèi)涵體標記物（early endosome antigen-1, EEA1）和溶酶體標記物（lysosomalassociated membrane protein-1, LAMP1）的共定位，運用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0測量AQP4與EEA1/LAMP1共表達的比例。 ⑵初步探討AQP4內(nèi)化和溶酶體分選的機制： 在腦缺血模型中，經(jīng)頸外靜脈注射蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）激動劑佛波酯（phorbol12-myristate13-acetate, PMA），采用干濕重法、透射電鏡觀察及Western Blot分別檢測腦含水量，星形膠質(zhì)細胞水腫程度和AQP4蛋白的表達；采用免疫熒光雙標檢測AQP4分別與EEA1及LAMP1的共定位，運用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0測量AQP4與EEA1/LAMP1共表達的比例。 第二部分 大鼠腦膜炎腦水腫模型建立及AQP4內(nèi)化和溶酶體分選： 經(jīng)幼鼠延髓小腦池注入B族溶血性鏈球菌（group B hemolyticStreptococcus, GBS）建立細菌性腦膜炎模型；采用干濕重法、伊文思藍（Evans Blue, EB）含量測定法、透射電鏡觀察、Western Blot等分別檢測腦膜炎幼年大鼠腦含水量、血腦屏障通透性以及AQP4，α-dystroglycan（α-DG）和β-dystroglycan（β-DG）的表達水平；采用免疫熒光雙標檢測AQP4分別與早期內(nèi)涵體標記物EEA1,晚期內(nèi)涵體標記物甘露糖-6-磷酸受體（mannose-6-phosphate receptor, MPR）及溶酶體標記物LAMP1的共表達，運用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0測量AQP4與EEA1/MPR/LAMP1共表達的比例。 結(jié)果 第一部分 ⑴大鼠缺血性腦水腫模型建立及AQP4內(nèi)化和溶酶體分選： ①TTC染色：正常對照組和缺血1h組未見缺血灶；缺血3h,6h,12h,24h組可見缺血灶；②電鏡觀察：缺血3h時，血管周圍膠質(zhì)細胞腫脹，血管內(nèi)皮細胞緊密連接未被破壞，血管基底膜完整；③缺血后各組（1h,3h,6h,12h,24h時間點）AQP4與EEA1共表達，共表達比例較對照組增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；④缺血后各時間點（3h,6h,12h,24h）AQP4與LAMP1共表達，共表達比例較對照組增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 ⑵AQP4內(nèi)化和溶酶體分選機制的研究： ①PMA處理后，腦含水量在缺血后1h,3h下降（與溶劑對照組比較，P＜0.05）；缺血6h及以后各時段，PMA對腦含水量無顯著影響（與溶劑對照組比較，P＞0.05）；②電鏡觀察：PMA處理后，缺血后（3h）血管周圍膠質(zhì)細胞水腫程度減輕（與溶劑對照組比較，P＜0.05）；③PMA處理后，缺血后（3h）AQP4表達水平下降（與溶劑對照組比較，P＜0.05）；④PMA處理后，缺血性腦水腫模型中，AQP4分別與EEA1及LAMP1共表達的比例較溶劑對照組無差異（P＞0.05）。 第二部分 大鼠腦膜炎腦水腫模型建立及AQP4內(nèi)化和溶酶體分選： ①模型組腦含水量較對照組增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；②模型組EB含量與對照組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；③電鏡觀察：血管周圍膠質(zhì)細胞腫脹，血管內(nèi)皮細胞緊密連接未被破壞，血管基底膜完整；④模型組AQP4表達水平較對照組增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；⑤模型組α-DG和β-DG蛋白表達水平較均對照組增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；⑥模型組中，AQP4分別與EEA1、MPR及LAMP1共表達，共表達比例較對照組增加（P＜0.05）。 結(jié)論 1.大鼠缺血性腦水腫模型中，存在AQP4內(nèi)化和溶酶體分選現(xiàn)象。 2. PKC激動劑PMA可下調(diào)AQP4的表達并減輕缺血早期細胞毒性腦水腫，但PMA對AQP4表達的下調(diào)作用不是通過促進AQP4內(nèi)化和溶酶體分選實現(xiàn)的。 3.大鼠腦膜炎腦水腫模型中，AQP4表達上調(diào)，同時存在AQP4內(nèi)化和溶酶體分選現(xiàn)象。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R741.02

【參考文獻】

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3 李敏;陳少軍;陳學群;杜繼曾;;腦水腫的AQP4調(diào)節(jié)機制研究進展[J];浙江大學學報(醫(yī)學版);2013年01期

本文編號：2501349