發(fā)布時(shí)間：2019-06-18 08:59

【摘要】：背景 腦水腫不僅可以導(dǎo)致腦細(xì)胞功能障礙，而且可造成顱內(nèi)高壓，影響腦的血液灌流，甚至形成腦疝而致病人死亡。腦水腫的發(fā)生與腦內(nèi)水轉(zhuǎn)運(yùn)異常有關(guān)。水通道蛋白-4（aquaporin-4,AQP4）是一種水轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它在腦內(nèi)呈極性分布于膠質(zhì)細(xì)胞膜上，包括星形膠質(zhì)細(xì)胞在微血管周圍形成的細(xì)胞足突，軟腦膜內(nèi)表面形成的膠質(zhì)界膜和室管膜細(xì)胞的基底膜等部位。這些部位都是腦實(shí)質(zhì)與腦血管或腦脊液相交界的部位，提示AQP4的這種極性分布形式在腦實(shí)質(zhì)與腦血管/腦脊液的水轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用。 腦水腫主要有細(xì)胞毒性和血管源性兩種類型，細(xì)胞毒性腦水腫的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)主要表現(xiàn)為水分在細(xì)胞內(nèi)滯留，細(xì)胞腫脹，但血腦屏障保持完整；而血管源性腦水腫則表現(xiàn)為水分在細(xì)胞間聚集，細(xì)胞間隙增大，血腦屏障破壞。AQP4在不同類型腦水腫中的作用不同。AQP4表達(dá)增加可促進(jìn)經(jīng)AQP4轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的水分，從而加重細(xì)胞毒性水腫；而AQP4表達(dá)增加卻有利于細(xì)胞間隙多余水分的清除，從而減輕血管源性水腫。因此，對(duì)于不同類型的腦水腫，針對(duì)AQP4有不同的治療策略：抑制AQP4的水轉(zhuǎn)運(yùn)功能有利于減輕細(xì)胞毒性水腫；而促進(jìn)AQP4的水轉(zhuǎn)運(yùn)功能有利于減輕血管源性腦水腫。 在腦缺血、癲癇和顱內(nèi)腫瘤等多種疾病造成腦水腫的動(dòng)物和患者腦內(nèi)，AQP4的蛋白表達(dá)水平和極性分布形式發(fā)生改變，但是其機(jī)制仍不明確。 有資料顯示，，包括AQP4在內(nèi)的部分膜蛋白可以從細(xì)胞膜內(nèi)化（internalization）至細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)伴隨其水轉(zhuǎn)運(yùn)功能的改變。內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的膜蛋白可被分選（sorting）至溶酶體，被水解酶降解。腦內(nèi)疾病所致的AQP4極性分布的改變是否與其內(nèi)化和分選過程有關(guān)，目前未見報(bào)道。 如果證實(shí)在腦水腫的發(fā)生過程中存在AQP4內(nèi)化和溶酶體分選的現(xiàn)象，將為針對(duì)AQP4對(duì)腦水腫進(jìn)行治療的策略提供新思路。促進(jìn)AQP4的內(nèi)化和溶酶體降解，以減少在細(xì)胞膜上發(fā)揮水轉(zhuǎn)運(yùn)功能的AQP4，進(jìn)而減少通過AQP4進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的水分，將有利于減輕細(xì)胞毒性腦水腫；而抑制AQP4的內(nèi)化和溶酶體降解將使AQP4仍呈極性分布于膠質(zhì)細(xì)胞膜上，有利于促進(jìn)細(xì)胞間隙中多余水分的清除以減輕血管源性腦水腫。 目的 在大鼠腦缺血和細(xì)菌性腦膜炎這兩種模型中，研究在腦水腫的發(fā)生發(fā)展過程中，是否存在AQP4內(nèi)化和溶酶體分選的現(xiàn)象并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。 內(nèi)容和方法 本研究包括兩部分：第一部分，研究在大鼠缺血性腦水腫模型中是否存在AQP4內(nèi)化和溶酶體分選，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討；第二部分，研究在大鼠腦膜炎腦水腫模型中是否存在AQP4內(nèi)化和溶酶體分選。 第一部分 ⑴研究在大鼠缺血性腦水腫模型中是否存在AQP4內(nèi)化和溶酶體分選： 用線栓法制作大腦中動(dòng)脈栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）的大鼠腦缺血模型；采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyl-tetrazolium chloride, TTC）染色方法觀察腦內(nèi)缺血的部位和程度；采用透射電鏡觀察腦缺血早期腦內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，以明確腦水腫的類型；運(yùn)用免疫熒光雙標(biāo)的方法檢測AQP4分別與早期內(nèi)涵體標(biāo)記物（early endosome antigen-1, EEA1）和溶酶體標(biāo)記物（lysosomalassociated membrane protein-1, LAMP1）的共定位，運(yùn)用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0測量AQP4與EEA1/LAMP1共表達(dá)的比例。 ⑵初步探討AQP4內(nèi)化和溶酶體分選的機(jī)制： 在腦缺血模型中，經(jīng)頸外靜脈注射蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）激動(dòng)劑佛波酯（phorbol12-myristate13-acetate, PMA），采用干濕重法、透射電鏡觀察及Western Blot分別檢測腦含水量，星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫程度和AQP4蛋白的表達(dá)；采用免疫熒光雙標(biāo)檢測AQP4分別與EEA1及LAMP1的共定位，運(yùn)用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0測量AQP4與EEA1/LAMP1共表達(dá)的比例。 第二部分 大鼠腦膜炎腦水腫模型建立及AQP4內(nèi)化和溶酶體分選： 經(jīng)幼鼠延髓小腦池注入B族溶血性鏈球菌（group B hemolyticStreptococcus, GBS）建立細(xì)菌性腦膜炎模型；采用干濕重法、伊文思藍(lán)（Evans Blue, EB）含量測定法、透射電鏡觀察、Western Blot等分別檢測腦膜炎幼年大鼠腦含水量、血腦屏障通透性以及AQP4，α-dystroglycan（α-DG）和β-dystroglycan（β-DG）的表達(dá)水平；采用免疫熒光雙標(biāo)檢測AQP4分別與早期內(nèi)涵體標(biāo)記物EEA1,晚期內(nèi)涵體標(biāo)記物甘露糖-6-磷酸受體（mannose-6-phosphate receptor, MPR）及溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP1的共表達(dá)，運(yùn)用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0測量AQP4與EEA1/MPR/LAMP1共表達(dá)的比例。 結(jié)果 第一部分 ⑴大鼠缺血性腦水腫模型建立及AQP4內(nèi)化和溶酶體分選： ①TTC染色：正常對(duì)照組和缺血1h組未見缺血灶；缺血3h,6h,12h,24h組可見缺血灶；②電鏡觀察：缺血3h時(shí)，血管周圍膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接未被破壞，血管基底膜完整；③缺血后各組（1h,3h,6h,12h,24h時(shí)間點(diǎn)）AQP4與EEA1共表達(dá)，共表達(dá)比例較對(duì)照組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；④缺血后各時(shí)間點(diǎn)（3h,6h,12h,24h）AQP4與LAMP1共表達(dá)，共表達(dá)比例較對(duì)照組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 ⑵AQP4內(nèi)化和溶酶體分選機(jī)制的研究： ①PMA處理后，腦含水量在缺血后1h,3h下降（與溶劑對(duì)照組比較，P＜0.05）；缺血6h及以后各時(shí)段，PMA對(duì)腦含水量無顯著影響（與溶劑對(duì)照組比較，P＞0.05）；②電鏡觀察：PMA處理后，缺血后（3h）血管周圍膠質(zhì)細(xì)胞水腫程度減輕（與溶劑對(duì)照組比較，P＜0.05）；③PMA處理后，缺血后（3h）AQP4表達(dá)水平下降（與溶劑對(duì)照組比較，P＜0.05）；④PMA處理后，缺血性腦水腫模型中，AQP4分別與EEA1及LAMP1共表達(dá)的比例較溶劑對(duì)照組無差異（P＞0.05）。 第二部分 大鼠腦膜炎腦水腫模型建立及AQP4內(nèi)化和溶酶體分選： ①模型組腦含水量較對(duì)照組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；②模型組EB含量與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；③電鏡觀察：血管周圍膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接未被破壞，血管基底膜完整；④模型組AQP4表達(dá)水平較對(duì)照組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；⑤模型組α-DG和β-DG蛋白表達(dá)水平較均對(duì)照組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；⑥模型組中，AQP4分別與EEA1、MPR及LAMP1共表達(dá)，共表達(dá)比例較對(duì)照組增加（P＜0.05）。 結(jié)論 1.大鼠缺血性腦水腫模型中，存在AQP4內(nèi)化和溶酶體分選現(xiàn)象。 2. PKC激動(dòng)劑PMA可下調(diào)AQP4的表達(dá)并減輕缺血早期細(xì)胞毒性腦水腫，但PMA對(duì)AQP4表達(dá)的下調(diào)作用不是通過促進(jìn)AQP4內(nèi)化和溶酶體分選實(shí)現(xiàn)的。 3.大鼠腦膜炎腦水腫模型中，AQP4表達(dá)上調(diào)，同時(shí)存在AQP4內(nèi)化和溶酶體分選現(xiàn)象。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R741.02

【參考文獻(xiàn)】

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2 趙玲玲;殷萍;鄒華芳;曠壽金;谷永紅;周建黨;;新生SD大鼠細(xì)菌性腦膜炎動(dòng)物模型的建立[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2006年19期

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本文編號(hào)：2501349