【摘要】：目的:顱內(nèi)動(dòng)脈瘤是一個(gè)威脅生命的疾病。其是自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血的首要病因,一旦動(dòng)脈瘤發(fā)生破裂出血,有極高的致殘率和死亡率。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的確切發(fā)病機(jī)制仍不十分明確,并且缺乏對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生進(jìn)行篩查和對(duì)其破裂的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估特異的生物學(xué)標(biāo)志物。通過(guò)文獻(xiàn)回顧,本課題組提出"動(dòng)脈穩(wěn)態(tài)"(Arterial Homeostasis)的概念,即對(duì)于血流應(yīng)力和血管退行性變所造成的損傷,動(dòng)脈血管自身存在著一定修復(fù)的能力,從而形成損傷與修復(fù)的動(dòng)態(tài)平衡來(lái)維持血管穩(wěn)定,這種平衡的打破可能是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制。遺傳學(xué)因素在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)病過(guò)程中所起的作用日益受到人們的關(guān)注。研究表明,富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)廣泛地表達(dá)于顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織平滑肌細(xì)胞層,而其對(duì)平滑肌細(xì)胞的作用尚不十分清楚。本論文旨在研究SPARC對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞的作用,以及這種作用是否影響了動(dòng)脈穩(wěn)態(tài),從而探討其在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能起到的作用。方法:本研究采用原代人臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(human umbilical arterial smooth muscle cells,HUASMCs)作為研究對(duì)象,將其分別暴露于含有(0、0.125、0.25、0.5、1、2和4ug/ml)SPARC的培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后,采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK8)檢測(cè)HUASMCs的細(xì)胞活力。將其分別暴露于含有(0、2ug/ml)SPARC的培養(yǎng)基2、6、12、24和48小時(shí)后,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HUASMCs的細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡比率的變化;并用Western Blot技術(shù)檢測(cè)HUASMCs中以下蛋白表達(dá)情況:細(xì)胞周期調(diào)控蛋白(P21、P53、CyclinD1),細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bcl2、Caspase-3、Cl eaved Caspase-3),明膠酶和金屬蛋白酶組織抑制劑(MMP2、MMP9、TIMP2、TIMP1)。結(jié)果:將HUASMCs暴露于含有(2、4ug/ml)SPARC的培養(yǎng)基,作用24小時(shí)后,細(xì)胞活力相較對(duì)照組分別為89.30±2.00%和87.57±2.17%(P0.05 vs.對(duì)照組)。暴露于含2ug/mlSPARC的培養(yǎng)基,作用12小時(shí)后,處于細(xì)胞周期G0/G1期的細(xì)胞比例為74.77±1.33%(P0.05vs.對(duì)照組);作用24小時(shí)后,處于早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞比例分別為7.38±1.25%和4.86±0.81%(P0.01 vs.對(duì)照組)。將HUASMCs暴露于含有2ug/ml SPARC的培養(yǎng)基,作用24小時(shí)后,蛋白免疫印跡灰度分析結(jié)果顯示,P21蛋白含量在2-12小時(shí)顯著提高(P0.05 vs.對(duì)照組),而P53蛋白的表達(dá)量在48小時(shí)內(nèi)并沒(méi)有顯著地改變(P0.05 vs.對(duì)照組);同時(shí),Bax蛋白水平顯著地上調(diào)并于24小時(shí)達(dá)到高峰(P0.01 vs.對(duì)照組),而B(niǎo)cl2蛋白在24小時(shí)內(nèi)無(wú)顯著變化但在48小時(shí)出現(xiàn)顯著地下調(diào)(P0.01 vs.對(duì)照組),Cleaved caspiase3蛋白也顯著上調(diào)并在24小時(shí)達(dá)到高峰(P0.05 vs.對(duì)照組);MMP2蛋白的含量顯著增加且在24小時(shí)達(dá)到高峰(P0.01 vs.對(duì)照組),TIMP2蛋白的表達(dá)水平相對(duì)保持穩(wěn)定;MMP9蛋白的表達(dá)量顯著增加,同時(shí)也伴隨著TIMP1蛋白含量的顯著上調(diào)(P0.05vs.對(duì)照組)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,SPARC可以通過(guò)提高P21蛋白的表達(dá)將HUASCMs細(xì)胞阻滯于細(xì)胞周期的G0/G1期,抑制HUASMCs細(xì)胞的增殖速度,還可以促進(jìn)HUASMCs進(jìn)行線粒體途徑的細(xì)胞凋亡,從而降低其細(xì)胞活力;SPARC也可能通過(guò)促進(jìn)明膠酶(MMP2、MMP9)的分泌,導(dǎo)致血管壁中細(xì)胞外基質(zhì)和內(nèi)彈力層的退行性變。結(jié)論:實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,SPARC可能通過(guò)增加對(duì)顱內(nèi)動(dòng)脈中膜、內(nèi)彈力層及其他細(xì)胞外基質(zhì)的損傷因素,同時(shí)降低其自我修復(fù)能力,打破動(dòng)脈血管損傷與修復(fù)的動(dòng)態(tài)平衡,導(dǎo)致顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的發(fā)生、發(fā)展、甚至破裂。
[Abstract]:Objective: The intracranial aneurysm is a life-threatening disease. It is the primary cause of the spontaneous subarachnoid hemorrhage, and once the aneurysm ruptures, there is a very high rate of disability and mortality. The exact pathogenesis of the intracranial aneurysm is still not very clear, and the lack of screening for the occurrence of intracranial aneurysms and the assessment of specific biological markers for the risk of their rupture. According to the literature review, the research group put forward the concept of the "arterial steady state" Homeostat, that is, to the damage caused by the blood flow stress and the degeneration of the blood vessel, the arterial blood tube has the ability to repair itself, so that the dynamic balance of the injury and the repair is formed to maintain the blood vessel stability, The break in this balance may be the pathogenesis of an intracranial aneurysm. Genetic factors play an increasingly important role in the pathogenesis of intracranial aneurysms. It is shown that the acidic secreted glycoprotein (SPARC), which is rich in cysteine, is widely expressed in the smooth muscle cell layer of the intracranial aneurysm, and its effect on smooth muscle cells is not clear. The purpose of this paper is to study the effect of SPARC on the human vascular smooth muscle cells, and whether the effect of this effect on the steady state of the artery, thus to explore the possible role of SPARC in the occurrence and development of the intracranial aneurysm. Methods: The primary human umbilical artery smooth muscle cells (HUASMCs) were used as the research object, and the cells were exposed to a medium containing (0, 0.125, 0.25, 0.5,1,2 and 4 ug/ ml) for 24 hours, and the cell viability of HUASMCs was detected by a cell count kit (CCK8). The cell cycle distribution and cell apoptosis rate of HUASMCs were detected by flow cytometry after 2,6,12,24 and 48 hours of medium containing (0,2 ug/ ml) of SPARC, respectively. The expression of the following proteins in HUASMCs was detected by Western Blot technique: cell cycle control protein (P21, P53, CyclinD1), Apoptosis-related proteins (Bax, Bcl2, Caspase-3, Ceaved Caspase-3), gelatinase and metalloprotease inhibitor (MMP2, MMP9, TIMP2, TIMP1). Results: HUASMCs were exposed to a medium containing (2,4 ug/ ml) of SPARC, and after 24 hours, the cell viability was 89.30% and 87.57% 2.17%, respectively (P0.05 vs. control group). After 12 hours of exposure to a medium containing 2 ug/ ml of SPARC, the proportion of cells in the G0/ G1 phase of the cell cycle was 74.77 and 1.33% (P0.05 vs. The proportion of cells in early and late-stage apoptosis was 7.38-1.25% and 4.86-0.81%, respectively (P0.01 vs. control group). When HUASMCs were exposed to a medium containing 2 ug/ ml of SPARC for 24 hours, the results showed that the content of P21 protein increased significantly in 2-12 hours (P0.05 vs. control group), while the expression of P53 protein did not change significantly within 48 hours (P0.05 vs. control group); at the same time, The level of Bax protein was up-regulated and peaked at 24 h (P0.01 vs. control group), while the Bcl2 protein did not change significantly within 24 hours, but decreased significantly in 48 hours (P0.01 vs. control group), and Cleared casei 3 protein was also up-regulated and reached its peak at 24 h (P0.05 vs. control group); The content of MMP2 protein was significantly increased and reached the peak at 24 h (P0.01 vs. control group), and the expression level of TIMP2 protein was relatively stable; the expression of MMP9 protein was significantly increased, with a significant increase in the content of TIMP1 protein (P0.05 vs. Control group). The results suggest that SPARC can block the proliferation of HUASMCs by increasing the expression of P21 protein in the G0/ G1 phase of the cell cycle, inhibit the proliferation of the HUASMCs, and promote the apoptosis of the cells of the HUASMCs in the mitochondria pathway, thereby reducing the cell viability of the HUASMCs. SPARC may also promote the gelatinase (MMP2, The secretion of MMP9 leads to the degeneration of the extracellular matrix and the inner elastic layer in the vascular wall. Conclusion: The results suggest that SPARC may increase the damage to the media, inner elastic layer and other extracellular matrix of the intracranial artery, reduce its self-healing ability, break the dynamic balance of the arterial injury and repair, and result in the occurrence and development of the intracranial aneurysm. And even break.
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R743

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本文編號(hào)：2492967