【摘要】：研究背景:缺血性卒中是世界上引起人類死亡和導(dǎo)致長期殘疾的主要原因之一。然而,目前世界上治療缺血性卒中特別是促進(jìn)缺失的神經(jīng)功能重建的方法十分有限。目前,建立卒中單元和用重組組織型纖溶酶原激活物(recombinant tissue plasminogen activator,r-tPA)進(jìn)行靜脈溶栓治療目前已被公認(rèn)可以改善缺血性卒中的預(yù)后,但是由于其狹窄的治療時間窗的限制,使得只有一小部分病人能從中獲益。功能康復(fù)治療能使卒中患者缺失的神經(jīng)功能得到一定程度上的恢復(fù),但是,康復(fù)治療的效果目前仍不是很樂觀。因此,研究者們正在努力探索降低缺血性卒中的死亡率和促進(jìn)神經(jīng)功能重建的新方法。目前干細(xì)胞移植成為治療卒中的新方法。已有報道骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)對缺血性卒中的神經(jīng)保護(hù)作用與其抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。但是,骨髓MSCs對其他參與卒中發(fā)病的細(xì)胞死亡方式,如parthanatos、壞死性凋亡和自噬的作用如何目前尚不清楚。目的:探討骨髓MSCs通過抑制哪些細(xì)胞死亡方式保護(hù)體外腦缺血模型的神經(jīng)元。方法:應(yīng)用全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)和差速貼壁法純化培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs。對原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元通過氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)和N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)損傷的方法建立體外腦缺血的模型。應(yīng)用具有0.4μm小孔的聚碳酸酯膜作為隔層的六孔板建立跨室共培養(yǎng)系統(tǒng),通過骨髓MSCs-腦缺血的神經(jīng)元共培養(yǎng)的方法建立骨髓MSCs移植治療缺血性卒中的體外模型。用2-溴化丙陡(propidiumiodide,PI)/Hoechst33342染色的方法測定神經(jīng)元的死亡率,并對MSCs與各種選擇性抑制細(xì)胞死亡的化學(xué)抑制劑的神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行比較。通過免疫熒光染色、蛋白印跡分析和熒光實(shí)時定量PCR的方法測定與骨髓MSCs共培養(yǎng)后缺血的神經(jīng)元的parthanatos死亡方式標(biāo)志物細(xì)胞核凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor,AIF)和多聚二磷酸腺苷核糖(Poly ADP-ribose,PAR)、壞死性凋亡的標(biāo)志物受體相互作用蛋白1(receptor interacting protein 1,RIP1)和受體相互作用蛋白 3(receptor interacting protein 3,RIP3)、細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物cleaved caspase-3以及自噬的標(biāo)志物Beclin1/輕鏈3-B(lightchain3-B,LC3B)表達(dá)的變化。結(jié)果:與骨髓MSCs共培養(yǎng)可以使OGD引起的神經(jīng)元死亡減少約73%～75%和使NMDA損傷引起的神經(jīng)元死亡下降約68%,其神經(jīng)保護(hù)作用優(yōu)于任何一種選擇性抑制細(xì)胞死亡的化學(xué)抑制劑。免疫熒光染色和蛋白印跡分析的結(jié)果表明,MSCs共培養(yǎng)通過減少AIF的入核而抑制parthanatos;通過下調(diào)RIP1/RIP3的表達(dá)而減少壞死性凋亡;通過降低cleaved caspase-3的表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡,但是對Beclin1的表達(dá)沒有調(diào)節(jié)作用。PCR檢測也得到了類似的結(jié)果。結(jié)論:MSCs共培養(yǎng)通過同時抑制parthanatos、壞死性凋亡和細(xì)胞凋亡保護(hù)缺血缺氧損傷的神經(jīng)元,而對自噬沒有影響。這個研究結(jié)果為骨髓MSCs對腦缺血模型的神經(jīng)保護(hù)作用增加了新的解釋機(jī)制,并且為MSCs移植治療缺血性卒中將來應(yīng)用于臨床提供了新的理論依據(jù)。
[Abstract]:Background: Ischemic stroke is one of the main causes of human death and long-term disability in the world. However, there is a limited number of methods currently in the world for the treatment of ischemic stroke, in particular for promoting the loss of neurological function. At present, a stroke unit and a recombinant tissue type plasminogen activator (r-tPA) are currently recognized to improve the prognosis of ischemic stroke, but due to its narrow treatment time window, So that only a small portion of the patient can benefit from it. Functional rehabilitation therapy can restore the neurological function of stroke patients to a certain extent, but the effect of rehabilitation therapy is still not very optimistic. Therefore, the researchers are working to explore new ways to reduce the death rate in ischemic stroke and to promote neurological recovery. Stem cell transplantation is a new method in the treatment of stroke. It has been reported that the neuroprotective effect of mesenchymal stem cells (MSCs) on ischemic stroke is related to the inhibition of neuronal apoptosis. However, the role of bone marrow MSCs on other types of cell death involved in stroke, such as parthenatos, necrotizing apoptosis and autophagy, is not yet clear. Objective: To study how to protect the neurons of the in vitro cerebral ischemia model by inhibiting which cell death methods. Methods: The bone marrow MSCs were cultured by full-bone marrow cell culture and differential adhesion method. The model of in vitro cerebral ischemia was established by means of oxygen-glucose deprivation (OGD) and N-methyl-D-aspartate (NMDA) injury to the primary cultured cortical neurons. A cross-chamber co-culture system was established by using a polycarbonate film with a small pore of 0.4. m u.m as an interlayer, and an in-vitro model of bone marrow MSCs transplantation for the treatment of ischemic stroke was established by means of co-culture of the bone marrow MSCs-cerebral ischemia. The mortality of neurons was measured by the method of 2-Bromide (PI)/ Hoechst33342, and the neuroprotective effects of MSCs with a variety of chemical inhibitors of selective inhibition of cell death were compared. The apoptosis-inducing factor (AIF) and polydiphosphate (PPAR) were determined by immunofluorescence staining, Western blot analysis and fluorescence real-time quantitative PCR. The expression of the marker-receptor interacting protein 1 (RIP1) and the receptor-interacting protein 3 (RIP3), the marker of apoptosis, and the expression of the self-phagemented marker Bechin1/ light chain 3-B (lightchmain3-B, LC3B) were observed. Results: The co-culture with bone marrow MSCs can reduce the neuronal death caused by OGD by about 73% ~ 75% and the neuronal death caused by NMDA injury by about 68%, and its neuroprotective effect is superior to any chemical inhibitor that can selectively inhibit cell death. The results of immunofluorescent staining and Western blot analysis showed that the co-culture of MSCs inhibited parthenatos by reducing the in-core of AIF, and decreased the apoptosis by down-regulating the expression of RIP1/ RIP3, but did not regulate the expression of Bechin1 by reducing the expression of the clear caspase-3. The PCR assay also results in a similar result. Conclusion: The co-culture of MSCs has no effect on autophagy by inhibiting parthenatos, necrotizing apoptosis and apoptosis. The results of this study provide a new interpretation mechanism for the neuroprotective effect of bone marrow MSCs on the cerebral ischemia model, and provide a new theoretical basis for the application of MSCs in the treatment of ischemic stroke.
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R743.3

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本文編號：2477921