【摘要】：腦卒中是一類具有高發(fā)病率，高死亡率和高致殘率的疾病，已經(jīng)成為全球危害人類健康的主要疾病之一。缺血再灌注損傷是誘發(fā)腦卒中的重要病理生理過程，其具體機制十分復(fù)雜，主要涉及到興奮性氨基酸神經(jīng)毒性、Ca2+超載、自由基生成增多、能量代謝障礙和炎癥反應(yīng)等�；钚匝踝杂苫�(Reactive Oxygen Species, ROS)生成增多被認為是腦缺血再灌注損傷病理過程的核心環(huán)節(jié)。然而，線粒體是細胞內(nèi)能量代謝和活性氧自由基的主要生成場所，在缺血再灌注應(yīng)激條件下對細胞氧化損傷和細胞死亡有著十分重要的調(diào)節(jié)作用。腦缺血再灌注時氧自由基迅速增多導(dǎo)致線粒體酶活性、蛋白及膜類結(jié)構(gòu)功能遭到破壞，引起氧化磷酸化功能和酶活性進一步降低，形成惡性循環(huán)。腦細胞線粒體功能紊亂與ROS生成增多可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central Nervous System，CNS）缺血性再灌注氧化損傷發(fā)生與發(fā)展的主要誘因之一。 金屬硫蛋白（metallothionein, MT），是一種廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中且具有清除氧自由基功能的小分子蛋白。金屬離子以及藥物毒性、缺血應(yīng)激等因素可以誘導(dǎo)CNS中MT-I/II（metallothionein-I/II, MT-I/II）表達明顯上調(diào)，在調(diào)節(jié)金屬離子穩(wěn)態(tài)、重金屬解毒、清除氧自由基、抗細胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用。缺血狀態(tài)下，MT-I/II可以通過清除ROS抗氧化應(yīng)激來保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。近年來研究提示，MTs作為一種多功能蛋白與線粒體功能調(diào)節(jié)具有密切聯(lián)系，在維持線粒體功能、促進線粒體生成和損傷修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用。鑒于MT具有多功能的特性，，在缺血應(yīng)激條件下對腦組織氧化損傷的病理過程具有重要影響及其與線粒體功能調(diào)節(jié)具有密切聯(lián)系，本課題擬通過研究MT-I/II對腦缺血再灌注氧化損傷的作用及其參與線粒體功能的調(diào)節(jié)，闡明MT-I/II在腦缺血再灌注應(yīng)激條件下對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用并探討其可能機制。我們假設(shè)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中MT-I/II通過抑制氧化應(yīng)激，促進線粒體生成和損傷修復(fù)來保護腦缺血再灌注損傷。 采用改良Longa線栓法分別對MT-I/II基因敲除C57BL/OLA129小鼠（MT-/-）和野生型小鼠（MT+/+）進行大腦中動脈阻塞術(shù)（Middle cerebralartery occlusion, MCAO），缺血2h后拔線栓恢復(fù)血流再灌注22h，建立小鼠腦缺血再灌注損傷模型。術(shù)后小鼠神經(jīng)功能發(fā)生明顯障礙，TTC染色結(jié)果顯示腦組織出現(xiàn)缺血病灶區(qū)，表明成功建立了小鼠腦缺血再灌注損傷模型。采用實時定量PCR（Real-time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）檢測結(jié)果顯示小鼠腦缺血再灌注可以誘導(dǎo)腦組織MT-I和MT-II的mRNA表達呈逐漸增高的趨勢；同樣，western blotting檢測結(jié)果顯示MT-I/II蛋白表達水平也呈逐漸增高的趨勢。對小鼠術(shù)后神經(jīng)功能進行評分，其結(jié)果顯示兩種小鼠的神經(jīng)功能障礙評分未出現(xiàn)顯著差異性。采用TTC染色評價兩種小鼠術(shù)后的缺血面積，結(jié)果顯示MT-/-小鼠腦缺血面積明顯高于MT+/+小鼠；HE染色觀察發(fā)現(xiàn)MT+/+和MT-/-小鼠腦組織均出現(xiàn)空泡狀、細胞溶解壞死及細胞核固縮等現(xiàn)象，且MT-/-比MT+/+小鼠更為嚴重；TUNEL檢測結(jié)果顯示腦缺血再灌注后腦細胞凋亡明顯增加，且MT-/-的凋亡率明顯高于MT+/+小鼠。通過檢測發(fā)現(xiàn)缺血再灌注后腦組織中MDA和蛋白羰基化含量明顯增高，且MT-/-明顯高于MT+/+小鼠（P0.05）；此外，缺血再灌注后MT-/-小鼠腦組織中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性發(fā)生明顯下降，而MT+/+小鼠腦組織SOD活性反而出現(xiàn)升高。對還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（Oxidized Glutathione，GSSG)檢測結(jié)果顯示MT+/+和MT-/-小鼠缺血再灌注后GSH含量和GSH/GSSG均明顯降低，且MT-/-小鼠下降程度較MT+/+小鼠明顯。對細胞凋亡信號因子procaspaes-3的表達水平觀察發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后procaspase-3蛋白表達明顯下降，且MT-/-小鼠要明顯低于MT+/+小鼠。為了探索MT-I/II與線粒體功能的關(guān)系，采用western blotting檢測缺血再灌注后腦組織中過氧化物增殖激活受體γ協(xié)同激活因子(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γCoactivator1-α, PGC1-α)、解偶聯(lián)蛋白2（Uncoupling protein2，UCP2）及2型超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase-2，SOD2）的表達變化，其結(jié)果顯示缺血再灌注應(yīng)激可以引起PGC1-α和UCP2表達水平明顯增加，且MT+/+小鼠明顯高于MT-/-小鼠；而MT+/+小鼠缺血再灌注后腦組織中SOD2表達水平增加，MT-/-小鼠的SOD2表達水平降低。 結(jié)論：腦缺血再灌注導(dǎo)致腦組織結(jié)構(gòu)功能發(fā)生嚴重損傷和細胞凋亡，且MT-I/II表達缺失可以明顯加重其損傷，提示MT-I/II對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。其機制一方面可能是MT-I/II通過抑制氧化應(yīng)激的作用來保護腦細胞損傷；另一方面MT-I/II通過參與對線粒體功能的調(diào)節(jié)，促進線粒體生成，抑制細胞凋亡的作用保護腦缺血再灌注引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。
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【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R743.3

【參考文獻】

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本文編號：2457609