【摘要】：研究目的：1、建立局灶性腦缺血再灌注損傷小鼠模型,檢測缺血側(cè)腦組織中磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)活性的變化,探討抑制AMPK活性在腦缺血再灌注損傷中的意義；2、以腦組織中的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞為研究對象,觀察局灶性腦缺血再灌注損傷后缺血側(cè)腦組織中二者的變化,探討抑制AMPK活性對星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的影響,初步了解抑制AMPK活性對于神經(jīng)炎癥損傷及其上游NFκB信號通路的影響；3、以細(xì)胞凋亡為切入點,觀察局灶性腦缺血再灌注損傷后缺血側(cè)腦組織中神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的情況,探討抑制AMPK活性對神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。研究方法：1、將成年健康雄性昆明小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組、鹽水對照組(腦缺血再灌注損傷模型組)、藥物干預(yù)組(Compound C給藥組)。制作小鼠MCAO/R模型,缺血1小時,再灌注24小時。藥物干預(yù)組在造模過程中,插入線栓時立即腹腔注射Compound C 20mg/kg,鹽水對照組在相同時間點給予等量生理鹽水腹腔注射,而假手術(shù)組則不給予任何藥物。應(yīng)用Western Blot方法檢測缺血側(cè)腦組織中磷酸化AMPK (pAMPK)的蛋白表達(dá)水平,神經(jīng)功能缺損評分評價小鼠神經(jīng)功能缺損癥狀,氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色觀察腦梗死體積。2、造模、動物分組及給藥方式同前,應(yīng)用免疫組化方法觀察缺血側(cè)腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物Ibal的陽性細(xì)胞表達(dá)情況,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測缺血側(cè)腦組織中Cx43 mRNA表達(dá),ELISA方法測定缺血側(cè)腦組織中TNFα和IL-1β的含量,Western Blot方法檢測缺血側(cè)腦組織中iNOS和NFκB/p65蛋白水平表達(dá)；3、造模、動物分組及給藥方式同前,應(yīng)用TUNEL染色觀察缺血側(cè)腦組織中神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況,應(yīng)用免疫組化染色觀察缺血側(cè)腦組織中凋亡誘導(dǎo)因子AIF陽性細(xì)胞表達(dá),Western Blot方法檢測缺血側(cè)腦組織細(xì)胞胞漿中細(xì)胞色素C (Cyt. C)的蛋白表達(dá)。研究結(jié)果：1、①假手術(shù)組小鼠腦組織中有少量pAMPK蛋白表達(dá)(皮質(zhì)0.70±0.197,海馬0.69±0.228),鹽水對照組(皮質(zhì)1.41±0.322,海馬1.51±0.418)和假手術(shù)組相比,pAMPK蛋白表達(dá)明顯增加,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；給予20mg/kg Compound C干預(yù)后,可顯著抑制pAMPK蛋白水平(皮質(zhì)0.93±0.229,海馬0.96±0.378),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(皮質(zhì)中：P0.01；海馬中：P0.05)。：,②假手術(shù)組小鼠神經(jīng)功能缺損評分為0分,鹽水對照組小鼠神經(jīng)功能缺損評分為(2.63±0.52)分,藥物干預(yù)組小鼠神經(jīng)功能缺損評分為(1.88±0.64)分,藥物干預(yù)組小鼠神經(jīng)功能缺損評分與鹽水對照組小鼠比較顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。③假手術(shù)組小鼠無腦梗死灶,鹽水對照組和藥物干預(yù)組小鼠腦梗死體積比分別為(49.57±9.71)%與(24.07±7.74)%。與鹽水對照組比較,藥物干預(yù)組小鼠腦梗死體積顯著縮小(P0.01)。2、①假手術(shù)組小鼠海馬區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)為(4.90±1.74)個/HP；鹽水對照組小鼠缺血側(cè)腦組織海馬區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)為(12.56±1.58)個/HP,顯著高于假手術(shù)組(P0.01)；藥物干預(yù)組小鼠缺血側(cè)腦組織海馬區(qū)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)為(9.27±0.61)個/HP,與鹽水對照組比較表達(dá)明顯減少(P0.05)。②假手術(shù)組Cx43 mRNA相對表達(dá)為(0.38±0.06),鹽水對照組Cx43 mRNA相對表達(dá)為(0.17±0.09),顯著低于假手術(shù)組(P0.05)；藥物干預(yù)組Cx43 mRNA相對表達(dá)為(0.35±0.09),與鹽水對照組比較表達(dá)顯著增加(P0.05)。③假手術(shù)組小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)Iba1陽性細(xì)胞數(shù)為(5.97±1.27)個/HP,鹽水對照組小鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)區(qū)Iba1陽性細(xì)胞數(shù)為(11.36±1.80)個/HP,較假手術(shù)組明顯增多(P0.05)；藥物干預(yù)組小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)Iba1陽性細(xì)胞數(shù)為(7.60±1.62)個/HP,較鹽水對照組顯著減少(P0.05)。④假手術(shù)組小鼠腦組織有少量TNF-α [(249.62 ± 48.37) pg/mg]、IL-1∞ [ (107.41 ±11.77) pg/mg]表達(dá),鹽水對照組小鼠缺血側(cè)腦組織TNF-α [(442.92±97.59) pg/mg]、IL-1β [(209.09±24.69) pg/mg]含量較假手術(shù)組顯著升高(P0.01)。和鹽水對照組比較,藥物干預(yù)組小鼠缺血側(cè)腦組織TNF-α [(290.60±61.40) pg/mg]、IL-1β[(142.61±20.60) pg/mg]含量顯著降低(P0.01)。⑤假手術(shù)組小鼠大腦皮層中有少量iNOS蛋白表達(dá),為(0.85±0.32),鹽水對照組小鼠缺血側(cè)腦組織皮層中iNOS蛋白表達(dá)顯著升高(P0.05),為(1.33±0.36),藥物干預(yù)組小鼠缺血側(cè)腦組織皮層中iNOS蛋白表達(dá)受抑制,為(0.96±0.31),較鹽水對照組小鼠明顯減少(P0.05)。⑥假手術(shù)組小鼠腦組織胞核內(nèi)有少量NF κ B/p65蛋白表達(dá)(皮質(zhì)0.72±0.243,海馬0.73±0.304),鹽水對照組小鼠缺血側(cè)腦組織胞核內(nèi)NF κ B/p65蛋白表達(dá)(皮質(zhì)1.42±0.370,海馬1.28±0.247)明顯增加,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；藥物干預(yù)組小鼠缺血側(cè)腦組織胞核內(nèi)NFκ B/p65蛋白表達(dá)(皮質(zhì)0.84±0.126,海馬0.95±0.146)顯著減少(皮質(zhì)中P0.01,海馬中P0.05)。3、①假手術(shù)組小鼠腦組織未見TUNEL染色陽性細(xì)胞,鹽水對照組皮質(zhì)區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)(81.00±12.21)個/HP、海馬區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)(56.00±5.29)個/HP,均較假手術(shù)組明顯增多(P0.05)；藥物干預(yù)組皮質(zhì)區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)(58.86±9.65)個/HP、海馬區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)(43.33±3.79)個/HP,均較鹽水對照組明顯減少(P0.05)。②假手術(shù)組皮質(zhì)區(qū)未見AIF陽性細(xì)胞表達(dá),海馬區(qū)見數(shù)個AIF陽性細(xì)胞；鹽水對照組皮質(zhì)區(qū)AIF陽性細(xì)胞數(shù)(46.70±3.45)個/HP、海馬區(qū)AIF陽性細(xì)胞數(shù)(17.35±3.67)個/HP,均較假手術(shù)組顯著增多(P0.05)；藥物干預(yù)組皮質(zhì)區(qū)AIF陽性細(xì)胞數(shù)(32.16±2.35)個/HP、海馬區(qū)AIF陽性細(xì)胞數(shù)(13.17±3.91)個/HP,較鹽水對照組均顯著減少(P0.05)。③假手術(shù)組小鼠腦組織胞漿中有少量Cyt.C蛋白表達(dá)(皮質(zhì)0.50±0.278,海馬0.51±0.257)；鹽水對照組(皮質(zhì)1.46±0.322,海馬1.61±0.441)和假手術(shù)組相比,缺血側(cè)腦組織胞漿中Cyt.C蛋白表達(dá)明顯增加,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；藥物干預(yù)組缺血側(cè)腦組織胞漿中Cyt.C的蛋白水平(皮質(zhì)1.02±0.174,海馬0.92±0.229),與鹽水對照組相比明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(皮質(zhì)：P0.05；海馬：P0.01)。研究結(jié)論：1、小鼠腦缺血再灌注損傷后,缺血側(cè)腦組織中AMPK過度激活,小鼠出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀,有明顯的腦梗死灶形成；抑制AMPK活性以后,可明顯改善小鼠神經(jīng)功能缺損癥狀,縮小腦梗死體積,說明抑制AMPK活性對腦缺血再灌注損傷具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用；2、小鼠腦缺血再灌注損傷后,缺血側(cè)腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化,星形膠質(zhì)細(xì)胞上Cx43 mRNA表達(dá)減少,相關(guān)炎癥因子TNFα、IL-1β和iNOS表達(dá)增加,NFκB/p65蛋白表達(dá)增加,抑制AMPK活性以后,抑制了星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化,促進(jìn)Cx43 mRNA表達(dá),減少TNF α、IL-1β、iNOS和NF κ B/p65表達(dá),說明抑制AMPK活性可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化,穩(wěn)定星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng),抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥損傷,并進(jìn)一步說明抑制AMPK活性的抗神經(jīng)炎癥的機(jī)制可能與抑制炎癥上游NFκB信號通路有關(guān)；3、小鼠腦缺血再灌注損傷后,缺血側(cè)腦組織中出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,同時AIF和Cyt.C釋放增多,抑制AMPK活性以后,神經(jīng)元細(xì)胞凋亡減少,AIF和Cyt.C的釋放也減少,說明抑制AMPK活性可以抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,其抗凋亡效應(yīng)可能與抑制線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743.3

【參考文獻(xiàn)】

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1 趙建新;田元祥;肖紅玲;胡滿香;陳偉然;;Effects of Electroacupuncture on Hippocampal and Cortical Apoptosis in A Mouse Model of Cerebral Ischemia-reperfusion Injury[J];Journal of Traditional Chinese Medicine;2011年04期

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本文編號：2455579