【摘要】：目的本研究選擇生長(zhǎng)分化因子 11(Growth differentiation factor 11,GDF11)與 C-C型趨化因子配體11(C-Cmotifchemokineligand11,CCL11)兩個(gè)蛋白進(jìn)行研究,首先對(duì)文獻(xiàn)中報(bào)道的RD公司GDF11抗體的特異性進(jìn)行檢測(cè);然后檢測(cè)正常獻(xiàn)血者血漿中GDF11和CCL11的含量,分析人血液中GDF11和CCL11水平與年齡、性別、血型等的相關(guān)性;利用HT22和C17.2小鼠神經(jīng)細(xì)胞,明確GDF11對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡、壞死、遷移、增殖、分化等的作用,研究GDF11發(fā)揮作用的信號(hào)通路,初步闡述其作用機(jī)制,探討GDF11在年齡相關(guān)的認(rèn)知功能減退中潛在的應(yīng)用價(jià)值,為后續(xù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究奠定理論基礎(chǔ)。方法1.采用SDS-PAGE及Western blot方法檢測(cè)RD公司GDF11抗體是否具有特異性。2.收集約300例不同年齡、性別、血型的正常獻(xiàn)漿人群的單人份新鮮冰凍血漿,-80℃凍存,待用,避免反復(fù)凍融。采用ELISA方法檢測(cè)血漿中GDF11、CCL11的含量,明確人血液中GDF11與CCL11的含量與年齡、性別、血型等的相關(guān)性。3.用完全培養(yǎng)基(含5%馬血清、10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基)將小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞系HT22或神經(jīng)干細(xì)胞系C17.2在37℃和5%(CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜后,更換為饑餓培養(yǎng)基(含1%胎牛血清和0.5%馬血清的高糖DMEM)繼續(xù)培養(yǎng)6h,然后①HT22細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組:棄去原有培養(yǎng)基,加入含有不同濃度GDF11(12.5、25、50、100ng/mL)的饑餓培養(yǎng)基培養(yǎng);C17.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組:分別加100ng/mLNGF,1OOng/mLGDF11,25ng/mLGDF11。②對(duì)照組:棄去原有培養(yǎng)基,加入與實(shí)驗(yàn)組相同體積的饑餓培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)6h,24h,36h或48h后,分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。4.GDF11處理96孔板中的HT22和C17.2細(xì)胞24h或48h后,倒置熒光顯微鏡觀察GDF11對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響,通過(guò)Hoechst和PI雙染法測(cè)定細(xì)胞凋亡和壞死情況,采用增強(qiáng)型CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力及增殖情況。5.對(duì)24孔板中的HT22細(xì)胞進(jìn)行人為劃痕損傷實(shí)驗(yàn),觀察損傷后不同濃度GDF11(12.5,25,50,100ng/mL)對(duì)細(xì)胞向劃痕處遷移能力的影響。6.通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)GDF11刺激12孔板中的HT22和C17.2細(xì)胞6h后細(xì)胞周期蛋白CyclingD2、神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白nestin、神經(jīng)元標(biāo)志蛋白βⅢ-Tubulin、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP及信號(hào)通路蛋白EGFR、Notch1等的mRNA表達(dá)情況。7.利用Western blot方法分析GDF11刺激6孔板中的HT22細(xì)胞后對(duì)TGF-β信號(hào)通路中的Smad2/3以及cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白Creb等蛋白的磷酸化的影響。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行圖表繪畫(huà)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。Western blot條帶采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。目的條帶灰度值經(jīng)對(duì)應(yīng)的內(nèi)參調(diào)整后,計(jì)算磷酸化蛋白與總蛋白的比值,同時(shí)將正常對(duì)照組磷酸化蛋白/總蛋白的比值設(shè)定為1,然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用單因素方差分析,雙組間的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。當(dāng)P0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.Western blot結(jié)果顯示:RD公司的GDF11單克隆抗體可結(jié)合GDF8,但與IgG單鏈不具有交叉反應(yīng)。2.ELISA結(jié)果顯示:人血漿中GDF11水平隨年齡增加呈遞減趨勢(shì),CCL11含量則隨年齡的增加而增加,并且在男性中顯著高于女性(P0.01),但血型間并無(wú)差異。3.Hoechst和PI雙染結(jié)果顯示:GDF11對(duì)HT22細(xì)胞凋亡、壞死無(wú)影響。4.增強(qiáng)型CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示:不同濃度GDF11處理海馬神經(jīng)細(xì)胞系HT22和神經(jīng)干細(xì)胞系C17.2 48h后,均表現(xiàn)出細(xì)胞活力增強(qiáng),且有顯著性差異(P0.01),但并無(wú)劑量依賴(lài)。5.劃痕損傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果:GDF11處理組遷移至劃痕損傷處的細(xì)胞數(shù)量相對(duì)對(duì)照組較少。6.qRT-PCR結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比,不同濃度GDF11處理細(xì)胞6h后,神經(jīng)元標(biāo)志物βⅢ-TubulinmRNA表達(dá)水平明顯增加(P0.01,n=3),但沒(méi)有劑量依賴(lài)性;細(xì)胞干性標(biāo)志物Nestin表達(dá)有所下降,星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP有所增加,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;細(xì)胞周期標(biāo)志物CyclinD2表達(dá)下調(diào)(P0.05,n=3),但沒(méi)有劑量依賴(lài)性;EGFR、Notch1表達(dá)下降,有顯著性差異(P0.05),且有劑量依賴(lài)性,表明GDF11可能通過(guò)抑制EGFR和Notch等信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化進(jìn)行調(diào)控。7.Western blot結(jié)果顯示:GDF11組(處理24h)與對(duì)照組相比,Smad2/3和Creb蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化,p-Smad2/3、p-Creb蛋白表達(dá)均顯著增加,但無(wú)顯著的劑量依賴(lài)性,表明不同濃度的GDF11均可激活Smad2/3和Creb的磷酸化,可能通過(guò)啟動(dòng)TGF-β/Smad2/3、Creb等信號(hào)通路對(duì)小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的增殖分化進(jìn)行調(diào)控。結(jié)論1.文獻(xiàn)報(bào)道中的RD公司的GDF11單克隆抗體不能辨別GDF11和GDF8,但也不會(huì)結(jié)合IgG輕鏈。2.人血漿中GDF11含量隨年齡增加有遞減趨勢(shì),CCL11含量隨年齡增加而增加,且在相同年齡的前提下男性血漿中含量高于女性,血型之間無(wú)差異。3.GDF11可能通過(guò)抑制Notch、EGFR信號(hào)通路,激活TGF-β、Creb信號(hào)通路等抑制HT22細(xì)胞的遷移,促進(jìn)HT22、C17.2細(xì)胞的增殖與分化。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R741

【參考文獻(xiàn)】

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1 王靜;何麗杰;鄧為民;;血清CCL11水平對(duì)結(jié)腸癌患者預(yù)后的影響[J];醫(yī)學(xué)與哲學(xué)(B);2016年05期

2 趙洪偉;魏智宇;候春梅;孫亮;許鳳燕;孫琪;吳樹(shù)亮;;年輕血液對(duì)衰老相關(guān)認(rèn)知功能障礙的改善作用[J];解剖科學(xué)進(jìn)展;2015年01期

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本文編號(hào)：2450075