【摘要】：研究背景腦出血是一種急性的、自發(fā)性的腦血管破裂,血液流入大腦實質(zhì)、腦室或者蛛網(wǎng)膜下腔的過程。作為腦卒中的一種亞型,腦出血具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率的特點,嚴重危害人類健康。腦出血對于大腦的損傷,分為原發(fā)性的血腫壓迫效應(yīng)和繼發(fā)性的血腫分解產(chǎn)物對于腦實質(zhì)的損傷。研究表明腦出血后繼發(fā)性損傷是影響腦出血患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。腦出血繼發(fā)性損傷的機制復(fù)雜,包括急性炎癥反應(yīng)、局部活性氧自由基釋放、血腫周圍的水腫效應(yīng)、凋亡、自噬等。腦出血后繼發(fā)性炎癥反應(yīng)目前被認為是腦出血繼發(fā)性損傷中的重要環(huán)節(jié),但其具體作用機制目前尚不明確。腦出血后,小膠質(zhì)細胞作為重要的神經(jīng)炎癥效應(yīng)細胞,最先被激活,經(jīng)過細胞形態(tài)學(xué)和生理學(xué)改變后,釋放一系列炎癥介質(zhì)和生物學(xué)活性因子:如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等,導(dǎo)致腦出血后炎癥反應(yīng)的發(fā)生,造成進一步繼發(fā)性損傷。因此,小膠質(zhì)細胞在腦出血后最初的炎癥反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。MicroRNAs(miRNAs,miRs)是一組具有18-25對堿基對的內(nèi)源性非編碼小RNA,它可以在細胞內(nèi)聚集,通過特異性結(jié)合靶基因的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)上的互補序列,下調(diào)靶基因的表達,從而起到調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的效果,對于維持細胞的生物活性具有非常重要的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)腦出血患者血腫周圍腦組織和血液中存在異常表達的miRs,并且認為miRs與腦出血后的病理生理變化和預(yù)后有關(guān),另外有些文獻提示miRs與炎癥的發(fā)生發(fā)展亦有著密切聯(lián)系。目的:構(gòu)建小膠質(zhì)細胞炎癥模型和大鼠腦出血模型,利用腺病毒轉(zhuǎn)染調(diào)控miRs的表達,從體內(nèi)體外兩方面來分析miR-21和miR-146a對于小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用,以及對于神經(jīng)細胞的保護作用。方法:(1)體外實驗:使用脂蛋白(LPS)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞發(fā)生炎癥反應(yīng),構(gòu)建小膠質(zhì)細胞炎癥模型,利用過表達miR-21和miR-146a的腺病毒轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細胞,以陰性表達的腺病毒為對照,利用定量PCR手段檢測各種腺病毒轉(zhuǎn)染后小膠質(zhì)細胞中miR-21和miR-146a的表達水平,利用ELISA手段檢測IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-9、IRAK1、TIMP3和TNF-α等炎癥因子的表達,統(tǒng)計學(xué)分析miR-21/miR-146a的表達和上述各種炎癥因子之間的關(guān)系。(2)體內(nèi)實驗:構(gòu)建大鼠腦出血模型,通過注射過表達miR-21和miR-146a的腺病毒,以陰性表達的腺病毒為對照,利用定量PCR手段檢測血腫周圍組織和對側(cè)基底節(jié)區(qū)腦組織中miR-21和miR-146a的表達水平,利用ELISA手段檢測IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-9、IRAK1、TIMP3 和 TNF-α 等炎癥因子的表達,統(tǒng)計學(xué)分析miR-21/miR-146a的表達和上述各種炎癥因子之間的關(guān)系。(3)利用HE染色出血后腦組織的切片,觀察腦出血后的組織病理形態(tài),利用TUNEL和DAPI雙熒光染色技術(shù),觀察過表達miR-21和miR-146a腺病毒注射后的腦組織中細胞凋亡情況。結(jié)果:(1)在LPS的炎癥刺激下,小膠質(zhì)細胞表達IL-1β、IL-8和TNF-α顯著增加。LPS劑量為1Oμg/ml,作用24h,小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)達峰值。(2)過表達miR-21腺病毒轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細胞,miR-21的表達水平是陰性對照組的2.17倍;而過表達miR-146a腺病毒轉(zhuǎn)染的小膠質(zhì)細胞,miR-146a的表達是陰性對照組的3.52倍。在LPS(10μg/ml)刺激下的小膠質(zhì)細胞,miR-21和miR-146a的表達分別為陰性對照組的1.53倍和2.1倍。(3)LPS刺激下的小膠質(zhì)細胞表達IL-1β、IL-6、IL-8、IRAK1、MMP-9和TNF-α的水平對照空白組顯著增加(p0.001),表達TIMP3顯著減少(p0.001)。通過腺病毒轉(zhuǎn)染小膠質(zhì)細胞使miR-21和miR-146a過表達后,可以顯著減少IL-1β、IL-6、IL-8、IRAK1、MMP-9 和 TNF-α 的表達(p0.001)。(4)大鼠腦出血模型中血腫周圍組織中IL-1β、IL-6、IRAK1和TNF-α的表達較健側(cè)顯著性增加(p0.001)。IL-1β、IL-6和IRAK1的表達在出血后12h達峰,出血后24h開始下降;而IL-8和TNF-α的表達在出血后24h達峰,出血后72h開始下降。MiR-21和miR-146a的表達在出血后12h開始下降,24h和72h下降最為明顯。(5)注射過表達miR-21、miR-146a腺病毒的大鼠腦出血模型,血腫周圍腦組織中miR-21和miR-146a的表達顯著增加(p0.001)。血腫周圍腦組織中IL-1β、IL-6、IL-8、IRAK1、MMP-9 和 TNF-α 的表達增高(p0.05),TIMP3 的表達降低(p0.01)。MiR-21 組和 miR-146a 組血腫周圍腦組織中 IL-1β、IL-6、IL-8、IRAKI、MMP-9的表達較對照組均顯著減少(p0.01),TIMP3的表達均顯著增加(p0.01)。(6)相較于陰性對照組,在正常腦組織中,miR-21組和miR--146a組TUNEL陽性細胞無明顯差異;而在血腫周圍組織中,miR-21組和miR-146a組TUNEL陽性細胞數(shù)量減少。結(jié)論:本課題從體內(nèi)和體外兩方面實驗論證了 miR-21和miR-146a可以減輕LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng),同時也可以減輕大鼠腦出血模型中腦組織的炎癥反應(yīng),具有保護神經(jīng)細胞的作用,為治療人類腦出血后繼發(fā)性炎癥損傷提供新的理論依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R743.34

【參考文獻】

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1 Xue-Mei Liu;Yi Feng;Ai-Min Li;;Effect of G-CSF and TPO on HIBD in neonatal rats[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2015年02期

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本文編號：2450033