【摘要】：目的：觀察谷氨酸對體外原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元損傷作用，研究腦源性生長因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）對谷氨酸損傷的神經(jīng)元保護作用及其相關機制，探討B(tài)DNF對損傷神經(jīng)元的N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）表達的影響。 方法： 1、體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元分為A組：正常對照組；B組:谷氨酸組、C組:BDNF組。A組：第7天的皮層神經(jīng)元經(jīng)原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時；B組：第7天的皮層神經(jīng)元加入50μmol/L的谷氨酸，作用30分鐘后改為原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時；C組：第6天的皮層神經(jīng)元通過50ng/ml BDNF孵育24小時后，經(jīng)50μmol/L谷氨酸作用30分鐘，再改為原培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時。然后應用MTT檢測三組皮層神經(jīng)元的損傷程度，運用共聚焦顯微鏡檢測三組皮層神經(jīng)元內(nèi)鈣離子水平。 2、體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元分為A1組即空白對照組、B1組即對照組、C1組即谷氨酸組、D1組即BDNF組、E1組即BDNF拮抗組（K252a組）。其中A1組：培養(yǎng)7天的皮層神經(jīng)元繼續(xù)原培養(yǎng)基培養(yǎng)；B1組：培養(yǎng)第6天的皮層神經(jīng)元經(jīng)50ng/mlBDNF孵育24小時后原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；C1組：第7天的皮層神經(jīng)元加入50μmol/L的谷氨酸，作用30分鐘后改為原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；D1組：培養(yǎng)第6天的皮層神經(jīng)元經(jīng)50ng/mlBDNF孵育24小時后再加入50μmol/L的谷氨酸，作用30分鐘后改為原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；E1組：培養(yǎng)第6天的皮層神經(jīng)元經(jīng)50ng/ml BDNF+K252a孵育24小時后加入50μmol/L的谷氨酸，作用30分鐘后改為原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在6小時、12小時、24小時時間點分別收集五組神經(jīng)元細胞，運用RT-PCR技術檢測NMDAR1mRNA在五組皮層神經(jīng)元的表達情況。通過westernblot了解NMDAR1蛋白在各組皮層神經(jīng)元表達情況，在谷氨酸受體激動劑NMDA刺激下應用共聚焦顯微鏡初步檢測各組皮層神經(jīng)元NMDAR受體的活性。 結(jié)果： 1、與正常對照組（0.8170±0.0323）相比，谷氨酸組存活率（0.7126±0.0320）明顯降低；與谷氨酸組相比，BDNF組（0.7858±0.0219）可以提高細胞存活率。 2、在共聚焦顯微鏡下，谷氨酸組皮層神經(jīng)元[Ca2+]i（128.1±2.5）、BDNF組皮層神經(jīng)元[Ca2+]（i125.8±3.5）較正常對照組皮層神經(jīng)元[Ca2+]（i112.4±2.0）高，，差異有統(tǒng)計學意義（p0.05)。 3、與C1組（谷氨酸組）相比，NMDAR1mRNA在D1組（BDNF組）及B1組（對照組）中6小時的轉(zhuǎn)錄明顯上升，有統(tǒng)計學差異（p0.05)，24小時轉(zhuǎn)錄量無差異（p＞0.05)，E1組（K252a組）中各時間段NMDAR1mRNA轉(zhuǎn)錄量無統(tǒng)計學差異（p＞0.05)。與B1組（對照組）相比，D1組（BDNF組）各時間段NMDAR1mRNA轉(zhuǎn)錄量無統(tǒng)計學差異（p＞0.05）。 4、與A1組（空白對照組）相比，B1組（對照組）NMDAR1蛋白在6h、12h表達明顯升高，24h降低，但仍高于A1組（空白對照組），差異有統(tǒng)計學意義（p0.05)。NMDAR1蛋白在B1組（對照組）、D1組（BDNF組）各時間段的表達量較C1組（谷氨酸組）及E1組（K252a組）升高，差異有統(tǒng)計學意義（p0.05)。D1組（BDNF組）中24h較6h、12h表達量下降，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05)。D1組（BDNF組）與B1組（對照組）各時間段表達量無差異，無統(tǒng)計學意義（p＞0.05)。C1組（谷氨酸組）與E1組（K252a組）各時間段表達量無統(tǒng)計學差異（p＞0.05)。在NMDA刺激下，30s后B1組（對照組）、D1組（BDNF組）細胞[Ca2+]i較C1組（谷氨酸組）和E1組（K252a組）顯著升高。 結(jié)論： 1、BDNF對谷氨酸損傷的神經(jīng)元具有保護作用，其機制并非通過減少損傷神經(jīng)元[Ca2+]i來降低神經(jīng)元損傷。 2、BDNF可增加谷氨酸損傷皮層神經(jīng)元的NMDAR1mRNA及蛋白的表達，增強其NMDA受體活性。
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【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R742.1


本文編號：2442343