【摘要】：帕金森病(PD)是以黑質(zhì)多巴胺(DA)能神經(jīng)元變形死亡為病理特征的一種神經(jīng)退行性疾病,發(fā)病年齡平均為60歲。臨床表現(xiàn)為肌強(qiáng)直、靜止性震顫、步態(tài)和姿勢(shì)不穩(wěn)等運(yùn)動(dòng)障礙,以及失眠、抑郁等非運(yùn)動(dòng)癥狀,會(huì)嚴(yán)重影響老年人的健康。引發(fā)該病的因素包括遺傳、環(huán)境、藥物等,由這些因素導(dǎo)致的線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)聚集、炎癥反應(yīng)等是主要機(jī)制,其中線粒體功能障礙可能是重要的機(jī)制之一。線粒體是細(xì)胞的能量供給中心,同時(shí)也是生成氧自由基(ROS)的主要場(chǎng)所,上述因素都可能使線粒體的電子傳遞鏈功能異常而生成ROS增加。ROS對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷,使DA能神經(jīng)元變形死亡而引發(fā)PD。有實(shí)驗(yàn)證明,自噬-溶酶體系統(tǒng)與PD的發(fā)病有關(guān),尤其與線粒體自噬密切相關(guān)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子-1α(PGC-1α)在劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)會(huì)高表達(dá),并與線粒體的生物發(fā)生和細(xì)胞自噬/線粒體自噬密切相關(guān),使其在骨骼肌細(xì)胞的重塑過(guò)程中起著重要作用。這提示,PGC-1α可能通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體的自噬和生物發(fā)生而對(duì)細(xì)胞的損傷有保護(hù)作用。那么,如果人為提高PGC-1α的表達(dá),能否對(duì)MPP+損傷的DA能神經(jīng)元進(jìn)行保護(hù)?其對(duì)細(xì)胞自噬/線粒體自噬有否影響?對(duì)在體DA能神經(jīng)元的損傷有否保護(hù)作用?對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞和炎癥反應(yīng)有否影響?這些都是非常值得探討的問(wèn)題。對(duì)這些問(wèn)題的解明將有助于確定PGC-1α能否作為防治PD的藥物靶點(diǎn)提供必要的實(shí)驗(yàn)證據(jù),具有一定的理論和實(shí)際意義。針對(duì)上述問(wèn)題,本研究擬以SH-SY5Y細(xì)胞和C57BL/6小鼠為研究對(duì)象,用MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷復(fù)制PD細(xì)胞模型,通過(guò)腹腔注射MPTP復(fù)制C57BL/6小鼠的PD模型。首先采用MTT比色法、FJC染色法、Hoechst 33342染色法來(lái)確定MPP+對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的最佳損傷條件;將細(xì)胞和動(dòng)物均分為CON組、MPP+(MPTP)組、NCOE+MPP+(MPTP)組和OE+MPP+(MPTP)組;在OE+MPP+(MPTP)組,用構(gòu)建好的PGC-lα過(guò)表達(dá)慢病毒對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞和小鼠中腦黑質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)染使其過(guò)表達(dá);通過(guò)MTT比色法檢測(cè)以上四組SH-SY5Y細(xì)胞的存活率的變化,然后采用Real-time PCR來(lái)探究PGC-lα過(guò)表達(dá)后線粒體相關(guān)基因和自噬相關(guān)基因mRNA水平的變化;用免疫熒光染色法來(lái)觀察中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元以及星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)變化,從而為上述問(wèn)題尋找答案。實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果如下:1.當(dāng)mpp+的濃度為1mmol/l,對(duì)細(xì)胞作用時(shí)間為24h時(shí),細(xì)胞存活率接近50%,所以mpp+的使用濃度1mmol/l作用24h為mpp+損傷的最適建模條件。2.通過(guò)fjc染色法、hoechst33342染色法檢測(cè)mpp+對(duì)sh-sy5y細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的損傷發(fā)現(xiàn),隨著與mpp+孵育時(shí)間的增加,細(xì)胞的凋亡率逐漸增加,說(shuō)明mpp+損傷與孵育時(shí)間成正相關(guān),由以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合考慮mpp+的損傷時(shí)間為24h,濃度為1mmol/l。3.利用pcr技術(shù)獲取目的基因后與線性載體進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化,對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行pcr鑒定,測(cè)序后與目的基因進(jìn)行比對(duì)得出重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果和目標(biāo)序列一致,獲得過(guò)表達(dá)載體。4.elisa法滴度檢測(cè)ncoe和oe病毒的滴度分別為1×109tu/ml和2×108tu/ml。5.通過(guò)mtt比色法測(cè)定pgc-1α過(guò)表達(dá)后細(xì)胞存活率,發(fā)現(xiàn)pgc-1α過(guò)表達(dá)后,細(xì)胞的存活率明顯上升。ncoe組較正常組無(wú)顯著性差異。oe組細(xì)胞的存活率較各組均有明顯升高的趨勢(shì),且與mpp+組和ncoe組比具有極顯著的差異(p0.01),和con組相比具有顯著性差異(p0.05)。6.real-timepcr檢測(cè)線粒體相關(guān)基因(nrf1、drp1、mfn2)、自噬相關(guān)基因(lc3b、p62)的表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)pgc-1α過(guò)表達(dá)后,nrf1mrna的表達(dá)也顯著升高,且與mpp+組和ncoe組比較均有極顯著差異(p0.01)。而線粒體分裂、融合基因drp1和mfn2的mrna表達(dá)也明顯升高。oe組drp1較mpp+組具有極顯著差異(p0.01)與ncoe組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。mfn2mrna的表達(dá)較mpp+組和ncoe組比較均有極顯著差異(p0.01)。自噬相關(guān)基因lc3b的mrna表達(dá)明顯降低,且與mpp+組和ncoe組比較均有極顯著差異(p0.01)。p62mrna的表達(dá)明顯升高,且與mpp+組和ncoe組比較均有極顯著差異(p0.01)。7.對(duì)小鼠進(jìn)行黑質(zhì)立體定位注射pgc-lα過(guò)表達(dá)慢病毒基因干預(yù)后,統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,小鼠中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量沒(méi)有明顯的改善,th陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá)各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)差異。免疫熒光檢測(cè)pgc-1α的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)oe組pgc-1α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較mptp組和ncoe組均有明顯增多的趨勢(shì),且具有極顯著差異(p0.01)。尤其是在黑質(zhì)的致密部,pgc-1α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多。雖然在細(xì)胞數(shù)上pgc-1α的表達(dá)是升高的,但是,由免疫熒光圖片我們可觀察到pgc-1α形態(tài)較為異常,細(xì)胞變得不規(guī)則。此外,免疫熒光統(tǒng)計(jì)結(jié)果也顯示了,小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)了過(guò)度激增的現(xiàn)象。通過(guò)對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析,得出如下結(jié)論:1.本研究檢測(cè)所得1 mmol/L的MPP+對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞損傷24 h為MPP+的最適建模條件。可成功復(fù)制出MPP+誘導(dǎo)的PD體外模型。2.PD細(xì)胞模型中,過(guò)表達(dá)PGC-lα可以抵抗MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性,抑制自噬的發(fā)生,增加MPP+損傷后NRF1的表達(dá),提高線粒體融合基因Mfn2的表達(dá)對(duì)于改善線粒體功能,維護(hù)線粒體分裂融合的動(dòng)態(tài)平衡起到了一定的作用,從而減少細(xì)胞的凋亡,進(jìn)而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。3.PD動(dòng)物模型中,PGC-1α過(guò)表達(dá)會(huì)引發(fā)黑質(zhì)處星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激增,對(duì)動(dòng)物體產(chǎn)生二次損傷的作用,因而對(duì)多巴胺能神經(jīng)元可能是一種損傷作用。本研究結(jié)果為后繼進(jìn)一步探討PGC-1α作為防治PD的藥物靶點(diǎn)提供了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R742.5

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本文編號(hào)：2441265