【摘要】：腦中風(fēng)以其高致死率、高致殘率嚴重危害人類健康,同時也為社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。近年來,眾多治療腦中風(fēng)的潛在療法和藥物常常因療效有限、副作用多等原因在臨床轉(zhuǎn)化過程中失敗,尋找到腦中風(fēng)治療新的靶點刻不容緩。興奮性神經(jīng)毒性是腦中風(fēng)最重要的病理基礎(chǔ),減輕興奮性毒性損傷是挽救神經(jīng)元的重要途徑,但目前以神經(jīng)元為靶標(biāo)的治療效果不盡人意。星形膠質(zhì)細胞是神經(jīng)元數(shù)量的5-10倍,以其對傷害刺激感受性強、耐受力好、調(diào)節(jié)度高等特性影響著神經(jīng)元的轉(zhuǎn)歸[1],所以開拓思路,著眼于“神經(jīng)-膠質(zhì)單元”將為腦中風(fēng)治療開辟新的航道。NDRG2是由我校藥立波教授所帶領(lǐng)的團隊于1999年首次發(fā)現(xiàn)與細胞分化、增殖以及應(yīng)激相關(guān)的新基因,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要表達于星形膠質(zhì)細胞,提示NDRG2極有可能參與星形膠質(zhì)細胞調(diào)節(jié)的生理和病理過程。我們前期研究發(fā)現(xiàn),NDRG2的RNA和蛋白表達在腦缺血再灌注后呈時間依賴性增加[2],在電針[3]和七氟醚[4]預(yù)處理誘導(dǎo)的腦缺血耐受過程中NDRG2也發(fā)揮了重要作用,說明NDRG2作為應(yīng)激反應(yīng)元件參與了腦缺血再灌注損傷的病理過程。該類實驗是以探索預(yù)處理對神經(jīng)保護作用為研究目的,在實驗設(shè)計上要求NDRG2作為預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷影響的一個觀測指標(biāo),其表達含量和分布在時間和空間上的變化不僅受到缺血再灌注的影響,還極有可能率先受到預(yù)處理的影響發(fā)生改變,至于NDRG2本身對腦缺血再灌注損傷的作用和機制仍不明確,我們的研究將首次對此進行探索�；谝陨涎芯拷Y(jié)果,本課題將對NDRG2在腦缺血再灌注損傷中的作用進行探索,并對其作用機制進行深入研究�！灸康摹�1、明確ndrg2對腦缺血再灌注損傷的影響;2、探索ndrg2影響興奮性氨基酸——谷氨酸含量的方式和作用途徑,以期明確ndrg2對腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護作用的機制;3、進一步探索ndrg2與na+-k+-atpaseβ1相互作用的有效肽段,在體內(nèi)、體外驗證其對ndrg2神經(jīng)保護作用的影響�！痉椒ā�1、構(gòu)建2-6外顯子ndrg2基因缺失的轉(zhuǎn)基因鼠(ndrg2-/-),以其同窩的野生型小鼠(wt)做對照。ndrg2-/-小鼠右側(cè)腦室注射ndrg2慢病毒(lv-ndrg2)和對照病毒(lv-ctrl)用于調(diào)節(jié)ndrg2在時間和空間上的表達。通過建立大腦中動脈閉塞(middlecerebralarteryocclusion,mcao)模型模擬局灶性腦缺血再灌注損傷,缺血60min后恢復(fù)灌注24hr。通過longa神經(jīng)功能學(xué)評分、ttc(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染色、缺血半暗帶處neun(neuron-specificnuclearprotein)陽性神經(jīng)元計數(shù)明確ndrg2對局灶性腦缺血再灌注損傷的影響。2、采用微透析定量檢測腦內(nèi)細胞外液神經(jīng)遞質(zhì)的濃度,電生理技術(shù)分析谷氨酸能神經(jīng)元sepsc的幅值和頻率,westernblot分析nmdar1蛋白質(zhì)的表達與分布,明確ndrg2對神經(jīng)細胞間興奮性電活動的影響;谷氨酸清除率的測定、westernblot方法用于分析ndrg2影響谷氨酸轉(zhuǎn)運方式和相關(guān)蛋白的表達;質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、免疫共沉淀方法在hek293細胞中檢測ndrg2與na+-k+-atpaseβ1的相互作用;病毒轉(zhuǎn)染、谷氨酸清除率的測定驗證na+-k+-atpaseβ1對ndrg2調(diào)節(jié)的谷氨酸轉(zhuǎn)運的作用。3、免疫共沉淀技術(shù)篩選na+-k+-atpaseβ1與ndrg2相互作用的關(guān)鍵肽段。在體外通過免疫共沉淀、westernblot、谷氨酸清除率證實該肽段對ndrg2與na+-k+-atpaseβ1相互作用及谷氨酸轉(zhuǎn)運的影響;在體內(nèi)通過對mcao60min再灌注24hr后神經(jīng)功能學(xué)評分、ttc染色和免疫熒光染色檢測有效肽段對局灶性腦缺血再灌注損傷的影響�！窘Y(jié)果】1、ndrg2對腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護作用ndrg2缺失可以使腦梗死容積和神經(jīng)功能學(xué)評分增加(p0.01),缺血半暗帶區(qū)單位面積里neun陽性細胞數(shù)減少(p0.01)。ndrg2-/-小鼠側(cè)腦室注射ndrg2慢病毒恢復(fù)星形膠質(zhì)細胞中NDRG2的表達,MCAO后腦梗死容積和神經(jīng)功能學(xué)評分顯著降低(p0.05),缺血半暗帶單位面積里NeuN陽性細胞數(shù)顯著恢復(fù)(p0.05)。2、NDRG2與Na~+-K~+-ATPaseβ1協(xié)同調(diào)節(jié)谷氨酸再攝取過程NDRG2缺失增加小鼠腦內(nèi)細胞外液基礎(chǔ)L-Glu濃度(p0.01),增加谷氨酸能神經(jīng)元sEPSC的幅度和頻率(p0.01),增加NMDAR1膜表達水平(p0.01),降低星形膠質(zhì)細胞對谷氨酸的清除能力(p0.01),降低Na~+-K~+-ATPaseβ1、EAAT1和EAAT2蛋白質(zhì)表達水平(p0.01)。Ndrg2-/-小鼠側(cè)腦室注射NDRG2慢病毒可以逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象(p0.05)。在HEK293細胞中證實NDRG2和Na~+-K~+-ATPaseβ1蛋白質(zhì)之間存在相互作用。Na~+-K~+-ATPaseβ1慢病毒可以顯著提高Ndrg2-/-星形膠質(zhì)細胞對Glu的清除能力(p0.05)。3、Na~+-K~+-ATPaseβ1_(244-263)是NDRG2與Na~+-K~+-ATPaseβ1相互作用并影響谷氨酸轉(zhuǎn)運進而影響NDRG2介導(dǎo)的神經(jīng)保護作用的關(guān)鍵肽段Na~+-K~+-ATPaseβ1244-363是NDRG2與Na~+-K~+-ATPaseβ1相互作用的關(guān)鍵態(tài)肽段。Na~+-K~+-ATPaseβ1_(244-263)可以干擾內(nèi)源性的NDRG2和Na~+-K~+-ATPaseβ1的相互作用,使二者解耦連,Na~+-K~+-ATPaseβ1半衰期顯著縮短,星形膠質(zhì)細胞對谷氨酸的清除能力顯著降低(p0.05),使MCAO60min,再灌注24 hr后小鼠腦內(nèi)細胞外液中L-Glu濃度顯著升高(p0.01),腦缺血再灌注后腦梗死容積和神經(jīng)功能學(xué)評分增加(p0.01),缺血半暗帶區(qū)單位面積NeuN陽性細胞數(shù)減少(p0.01)�！窘Y(jié)論】NDRG2可以通過Na~+-K~+-ATPase244-263肽段與Na~+-K~+-ATPaseβ1相互結(jié)合,穩(wěn)定Na~+-K~+-ATPaseβ1的半衰期。NDRG2與Na~+-K~+-ATPaseβ1協(xié)同調(diào)節(jié)Na~+依賴的興奮性谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT1和EAAT2的表達與功能,進而調(diào)節(jié)谷氨酸經(jīng)星形膠質(zhì)細胞再攝取的過程,維持突觸間適當(dāng)谷氨酸濃度和興奮性電活動,從而發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用。本研究豐富了NDRG2的生物學(xué)功能,為開發(fā)腦缺血的防治提供了新的靶點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R743.3

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本文編號：2439889