發(fā)布時間：2019-03-13 18:52

【摘要】：研究背景多形性膠質母細胞瘤(Glioblastoma multiforme, GBM)是成人顱內常見原發(fā)惡性腫瘤,由于腫瘤廣泛侵襲周圍正常腦組織,腫瘤全切困難。盡管通過手術、放療、化療等綜合治療手段,其預后仍然不佳,患者總體中位生存期在14-16個月。對于GBM侵襲的分子機制,國內外學者進行了大量的研究。受體酪氨酸激酶信號通路、細胞外基質蛋白分子和細胞跨膜蛋白分子起了重要作用。細胞周期依賴性激酶相關磷酸酶(cyclin-dependent kinase-associated phosphatase,KAP)通過Cdc2依賴的侵襲途徑促進GBM的侵襲。KAP是一雙重特異性磷酸酶,通過去磷酸化Cdk2,抑制Cdk2的活性和細胞周期的進展。在乳腺癌、前列腺癌和肝癌中,KAP表達上調可增加腫瘤形成。假定KAP抑制細胞周期的進展,其上調增加腫瘤形成的機制難以解釋。來自于肝細胞癌的研究可能解釋這種現(xiàn)象,在肝細胞癌中,雖然KAP mRNA表達增加,但由于異常剪接的KAP mRNA編碼缺乏Cdk2去磷酸化活性的KAP蛋白,導致大量無功能的KAP蛋白生成。在GBM中,KAP mRNA表達增加,但由于剪接異常,實際上產生大量無功能性KAP蛋白。KAP活性降低導致Cdc2表達上調,同時應用Cdc2抑制劑可拮抗GBM細胞的增殖和遷移過程。但是,KAP如何調節(jié)Cdc2依賴的GBM侵襲途徑,其詳細機制仍然未明。除剪接外,基因表達的后轉錄調節(jié)可影響KAP蛋白的表達。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一種內源性非編碼RNA,長度一般為20-25個核苷酸,其通過與靶基因的mRNA 3'UTR互補結合,影響蛋白的翻譯,因此,在后轉錄水平下調基因的表達。MiRNA通過與增殖和侵襲的相關基因靶向性結合,調節(jié)這些蛋白的表達,進而調節(jié)腫瘤的增殖、侵襲和轉移。此前報道,mir-26a基因在GBM中高表達,其通過與PTEN、RB1、MEKK2等抑癌基因靶向結合,下調其表達促進GBM細胞的增殖和侵襲。在肺癌中miR-26a通過與PTEN的3'UTR靶向性結合促進肺癌的侵襲及轉移,這種現(xiàn)象也可能存在GBM細胞系中。但在鼻咽癌和肝細胞癌中,miR-26a可抑制腫瘤侵襲和轉移。因此,miR-26a對侵襲的作用具有組織特異性,miR-26a對GBM侵襲能力如何調節(jié),其在PTEN突變／缺失的GBM中的靶點和作用機制如何,國內外文獻未見相關報道。本文顯示miR-26a直接與KAP mRNA 3'UTR靶向性結合,在后轉錄水平下調KAP蛋白表達。同時KAP蛋白表達減少激活兩條不同的途徑,最終導致Cdc2蛋白表達增加,促進GBM細胞的侵襲過程。一條途徑為KAP降低導致ROCK2減少,ROCK2減少直接激活Racl依賴的侵襲途徑；另一條途徑為KAP降低直接激活CDK2, CDK2去磷酸化Rb使Rb基因失活進而激活轉錄因子E2F,E2F直接激活Cdc2依賴的侵襲途徑。因此,miR-26a通過KAP/ROCK2/CDK2途徑促進GBM細胞侵襲,我們發(fā)現(xiàn)驗證miR-26a靶向性結合的新的基因位點,這一調節(jié)在PTEN缺失的GBM中發(fā)揮重要作用,同時我們發(fā)現(xiàn)KAP在GBM侵襲中的作用和具體機制。實驗目的細胞周期依賴性激酶相關磷酸酶(KAP)通過Cdc2依賴的調節(jié)GBM細胞侵襲,然而,KAP調節(jié)Cdc2依賴侵襲通路的詳細機制仍然未明。我們通過KAP免疫共沉淀結合蛋白質譜分析的方法,篩選與KAP密切相關的Rho激酶家族成員ROCK1,ROCK2,ROCKβ,驗證KAP/ROCK2/Racl依賴性的GBM侵襲通路。同時阻斷上述通路并不能完全阻斷GBM細胞的侵襲能力。進一步實驗發(fā)現(xiàn)KAP下調直接激活CDK2表達使Rb去磷酸化進而激活轉錄因子E2F,E2F激活Cdc2依賴的侵襲途徑,驗證KAP/CDK2/Cdc2侵襲途徑。同時檢測miR-26a在PTEN突變／缺失的GBM中的作用,通過預測發(fā)現(xiàn)miR-26a能與KAP mRNA3'UTR種子區(qū)域結合,驗證miR-26a是否在后轉錄水平調節(jié)直接下調KAP蛋白表達,通過上述通路激活Cdc2依賴的GBM侵襲途徑。方法1) 采用原代培養(yǎng)GBM細胞從標本中分離、培養(yǎng)膠質瘤干細胞(glioma stem cells, GSCs)并移植到裸鼠腦內,應用Cdk2/Cdc2抑制劑治療后觀察GSCs的遷移距離；應用直接表達miR-26a的細胞株植入裸鼠腦內,觀察其侵襲能力。2) 構建并克隆KAP高表達質粒,shKAP, miR-26表達質粒及相應對照質粒,應用脂質體轉染并包裝成具有感染能力的慢病毒,應用濃縮后的病毒上清感染GBM細胞系U87、U251和LN229,應用壓力選擇制備穩(wěn)定表達上述基因或miRNA的細胞系。3) 采用免疫細胞化學的方法對處理的細胞進行染色鑒定KAP和ROCK1/2在胞內的表達部位；鑒定細胞侵襲有關的絲狀偽足的多少。4) 應用Real-time PCR檢測不同條件處理的細胞中KAP,miR-26a的表達情況。5) 應用western Blot檢測miR-26a下游KAP,ROCK1/2ROCKβ、Rac1、CDK2、 CDK4、CDK6、Rb及其不同的磷酸化位點,Cdc2、pCdc2、CyclinD1、 Cadesman等的表達情況。6) 應用Transwell檢測IniR-26a表達和KAP表達對GBM細胞侵襲能力的影響。7) 構建熒光素酶報告基因KAP mRNA 3'UTR和KAP mRNA 3'UTR突變位點,檢測1niR-26a 與KAP mRNA 3'UTR種子區(qū)域直接結合的能力。8) 應用Rac1活性試劑盒測定miR-26a和KAP對Racl激活能力的影響。應用ROCK2活性測定試劑盒檢測ROCK磷酸化活性位點。結果1) KAP可與ROCK2,ROCK1, ROCKβ直接結合,KAP蛋白表達下調同時減少與之結合的ROCK2蛋白可激活下游的Racl蛋白。2) KAP蛋白表達下調直接激活CDK2蛋白表達上調使Rb去磷酸化進而激活轉錄因子E2F,E2F直接激活Cdc2依賴的GBM細胞侵襲通路。3) KAP表達下調和ROCK抑制也增加Caldesman磷酸化,證實KAP調節(jié)細胞的遷移活性通過調節(jié)Caldesman的活性。4) 應用Cdk2和Cdc2的小分子抑制齊Jpurvalanol A阻斷KAP依賴的侵襲途徑,結果發(fā)現(xiàn)purvalanol A在體外能夠明顯減少GSCs的侵襲能力。5) miR-26a可通過與PTEN mRNA 3'UTR靶向結合通過Akt途徑促進GBM細胞侵襲,在PTEN缺陷的GBM細胞系U251和U87中可通過下調KAP表達,激活Cdc2依賴的GBM通路。6) miR-26a通過與KAP mRNA 3'UTR靶向性結合促進GBM的侵襲,KAPmRNA 3'UT Rf中子區(qū)域內兩個堿基改變可消除這種靶向結合。結論1)miR-26a直接與KAP mRNA 3'UTR靶向性結合導致KAP蛋白表達減少。2) 同時KAP減少激活兩條不同的途徑,最終導致Cdc2蛋白表達增加,促進GBM細胞的侵襲能力。3) 一條途徑為KAP降低導致ROCK2減少,ROCK2減少直接激活Racl依賴的侵襲途徑,進而激活Cyclin D1表達增加；4) 另一條途徑為KAP降低直接激活CDK2,CDK2去磷酸化Rb使Rb基因失活進而激活轉錄因子E2F,E2F激活Cdc2依賴的GBM細胞侵襲通路。5) miR-26a通過KAP/ROCK2/CDK2通路促進GBM細胞侵襲及細胞周期進展,這一途徑是不依賴PTEN的新的miR-26a靶點和新的GBM細胞侵襲途徑。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41
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本文編號：2439676