【摘要】：研究背景多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma multiforme, GBM)是成人顱內(nèi)常見原發(fā)惡性腫瘤,由于腫瘤廣泛侵襲周圍正常腦組織,腫瘤全切困難。盡管通過手術(shù)、放療、化療等綜合治療手段,其預(yù)后仍然不佳,患者總體中位生存期在14-16個月。對于GBM侵襲的分子機(jī)制,國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究。受體酪氨酸激酶信號通路、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分子和細(xì)胞跨膜蛋白分子起了重要作用。細(xì)胞周期依賴性激酶相關(guān)磷酸酶(cyclin-dependent kinase-associated phosphatase,KAP)通過Cdc2依賴的侵襲途徑促進(jìn)GBM的侵襲。KAP是一雙重特異性磷酸酶,通過去磷酸化Cdk2,抑制Cdk2的活性和細(xì)胞周期的進(jìn)展。在乳腺癌、前列腺癌和肝癌中,KAP表達(dá)上調(diào)可增加腫瘤形成。假定KAP抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展,其上調(diào)增加腫瘤形成的機(jī)制難以解釋。來自于肝細(xì)胞癌的研究可能解釋這種現(xiàn)象,在肝細(xì)胞癌中,雖然KAP mRNA表達(dá)增加,但由于異常剪接的KAP mRNA編碼缺乏Cdk2去磷酸化活性的KAP蛋白,導(dǎo)致大量無功能的KAP蛋白生成。在GBM中,KAP mRNA表達(dá)增加,但由于剪接異常,實(shí)際上產(chǎn)生大量無功能性KAP蛋白。KAP活性降低導(dǎo)致Cdc2表達(dá)上調(diào),同時應(yīng)用Cdc2抑制劑可拮抗GBM細(xì)胞的增殖和遷移過程。但是,KAP如何調(diào)節(jié)Cdc2依賴的GBM侵襲途徑,其詳細(xì)機(jī)制仍然未明。除剪接外,基因表達(dá)的后轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)可影響KAP蛋白的表達(dá)。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼RNA,長度一般為20-25個核苷酸,其通過與靶基因的mRNA 3'UTR互補(bǔ)結(jié)合,影響蛋白的翻譯,因此,在后轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)基因的表達(dá)。MiRNA通過與增殖和侵襲的相關(guān)基因靶向性結(jié)合,調(diào)節(jié)這些蛋白的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。此前報(bào)道,mir-26a基因在GBM中高表達(dá),其通過與PTEN、RB1、MEKK2等抑癌基因靶向結(jié)合,下調(diào)其表達(dá)促進(jìn)GBM細(xì)胞的增殖和侵襲。在肺癌中miR-26a通過與PTEN的3'UTR靶向性結(jié)合促進(jìn)肺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移,這種現(xiàn)象也可能存在GBM細(xì)胞系中。但在鼻咽癌和肝細(xì)胞癌中,miR-26a可抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。因此,miR-26a對侵襲的作用具有組織特異性,miR-26a對GBM侵襲能力如何調(diào)節(jié),其在PTEN突變／缺失的GBM中的靶點(diǎn)和作用機(jī)制如何,國內(nèi)外文獻(xiàn)未見相關(guān)報(bào)道。本文顯示miR-26a直接與KAP mRNA 3'UTR靶向性結(jié)合,在后轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)KAP蛋白表達(dá)。同時KAP蛋白表達(dá)減少激活兩條不同的途徑,最終導(dǎo)致Cdc2蛋白表達(dá)增加,促進(jìn)GBM細(xì)胞的侵襲過程。一條途徑為KAP降低導(dǎo)致ROCK2減少,ROCK2減少直接激活Racl依賴的侵襲途徑；另一條途徑為KAP降低直接激活CDK2, CDK2去磷酸化Rb使Rb基因失活進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子E2F,E2F直接激活Cdc2依賴的侵襲途徑。因此,miR-26a通過KAP/ROCK2/CDK2途徑促進(jìn)GBM細(xì)胞侵襲,我們發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證miR-26a靶向性結(jié)合的新的基因位點(diǎn),這一調(diào)節(jié)在PTEN缺失的GBM中發(fā)揮重要作用,同時我們發(fā)現(xiàn)KAP在GBM侵襲中的作用和具體機(jī)制。實(shí)驗(yàn)?zāi)康募?xì)胞周期依賴性激酶相關(guān)磷酸酶(KAP)通過Cdc2依賴的調(diào)節(jié)GBM細(xì)胞侵襲,然而,KAP調(diào)節(jié)Cdc2依賴侵襲通路的詳細(xì)機(jī)制仍然未明。我們通過KAP免疫共沉淀結(jié)合蛋白質(zhì)譜分析的方法,篩選與KAP密切相關(guān)的Rho激酶家族成員ROCK1,ROCK2,ROCKβ,驗(yàn)證KAP/ROCK2/Racl依賴性的GBM侵襲通路。同時阻斷上述通路并不能完全阻斷GBM細(xì)胞的侵襲能力。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KAP下調(diào)直接激活CDK2表達(dá)使Rb去磷酸化進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子E2F,E2F激活Cdc2依賴的侵襲途徑,驗(yàn)證KAP/CDK2/Cdc2侵襲途徑。同時檢測miR-26a在PTEN突變／缺失的GBM中的作用,通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-26a能與KAP mRNA3'UTR種子區(qū)域結(jié)合,驗(yàn)證miR-26a是否在后轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)直接下調(diào)KAP蛋白表達(dá),通過上述通路激活Cdc2依賴的GBM侵襲途徑。方法1) 采用原代培養(yǎng)GBM細(xì)胞從標(biāo)本中分離、培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells, GSCs)并移植到裸鼠腦內(nèi),應(yīng)用Cdk2/Cdc2抑制劑治療后觀察GSCs的遷移距離；應(yīng)用直接表達(dá)miR-26a的細(xì)胞株植入裸鼠腦內(nèi),觀察其侵襲能力。2) 構(gòu)建并克隆KAP高表達(dá)質(zhì)粒,shKAP, miR-26表達(dá)質(zhì)粒及相應(yīng)對照質(zhì)粒,應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染并包裝成具有感染能力的慢病毒,應(yīng)用濃縮后的病毒上清感染GBM細(xì)胞系U87、U251和LN229,應(yīng)用壓力選擇制備穩(wěn)定表達(dá)上述基因或miRNA的細(xì)胞系。3) 采用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法對處理的細(xì)胞進(jìn)行染色鑒定KAP和ROCK1/2在胞內(nèi)的表達(dá)部位；鑒定細(xì)胞侵襲有關(guān)的絲狀偽足的多少。4) 應(yīng)用Real-time PCR檢測不同條件處理的細(xì)胞中KAP,miR-26a的表達(dá)情況。5) 應(yīng)用western Blot檢測miR-26a下游KAP,ROCK1/2ROCKβ、Rac1、CDK2、 CDK4、CDK6、Rb及其不同的磷酸化位點(diǎn),Cdc2、pCdc2、CyclinD1、 Cadesman等的表達(dá)情況。6) 應(yīng)用Transwell檢測IniR-26a表達(dá)和KAP表達(dá)對GBM細(xì)胞侵襲能力的影響。7) 構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因KAP mRNA 3'UTR和KAP mRNA 3'UTR突變位點(diǎn),檢測1niR-26a 與KAP mRNA 3'UTR種子區(qū)域直接結(jié)合的能力。8) 應(yīng)用Rac1活性試劑盒測定miR-26a和KAP對Racl激活能力的影響。應(yīng)用ROCK2活性測定試劑盒檢測ROCK磷酸化活性位點(diǎn)。結(jié)果1) KAP可與ROCK2,ROCK1, ROCKβ直接結(jié)合,KAP蛋白表達(dá)下調(diào)同時減少與之結(jié)合的ROCK2蛋白可激活下游的Racl蛋白。2) KAP蛋白表達(dá)下調(diào)直接激活CDK2蛋白表達(dá)上調(diào)使Rb去磷酸化進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子E2F,E2F直接激活Cdc2依賴的GBM細(xì)胞侵襲通路。3) KAP表達(dá)下調(diào)和ROCK抑制也增加Caldesman磷酸化,證實(shí)KAP調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移活性通過調(diào)節(jié)Caldesman的活性。4) 應(yīng)用Cdk2和Cdc2的小分子抑制齊Jpurvalanol A阻斷KAP依賴的侵襲途徑,結(jié)果發(fā)現(xiàn)purvalanol A在體外能夠明顯減少GSCs的侵襲能力。5) miR-26a可通過與PTEN mRNA 3'UTR靶向結(jié)合通過Akt途徑促進(jìn)GBM細(xì)胞侵襲,在PTEN缺陷的GBM細(xì)胞系U251和U87中可通過下調(diào)KAP表達(dá),激活Cdc2依賴的GBM通路。6) miR-26a通過與KAP mRNA 3'UTR靶向性結(jié)合促進(jìn)GBM的侵襲,KAPmRNA 3'UT Rf中子區(qū)域內(nèi)兩個堿基改變可消除這種靶向結(jié)合。結(jié)論1)miR-26a直接與KAP mRNA 3'UTR靶向性結(jié)合導(dǎo)致KAP蛋白表達(dá)減少。2) 同時KAP減少激活兩條不同的途徑,最終導(dǎo)致Cdc2蛋白表達(dá)增加,促進(jìn)GBM細(xì)胞的侵襲能力。3) 一條途徑為KAP降低導(dǎo)致ROCK2減少,ROCK2減少直接激活Racl依賴的侵襲途徑,進(jìn)而激活Cyclin D1表達(dá)增加；4) 另一條途徑為KAP降低直接激活CDK2,CDK2去磷酸化Rb使Rb基因失活進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子E2F,E2F激活Cdc2依賴的GBM細(xì)胞侵襲通路。5) miR-26a通過KAP/ROCK2/CDK2通路促進(jìn)GBM細(xì)胞侵襲及細(xì)胞周期進(jìn)展,這一途徑是不依賴PTEN的新的miR-26a靶點(diǎn)和新的GBM細(xì)胞侵襲途徑。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41
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本文編號：2439676