【摘要】：先天性肌病(Congenital myopathies,CMs)是一組單基因遺傳性骨骼肌疾病,臨床多以新生兒/幼年起病肌無(wú)力,伴/不伴肌張力低下,病情穩(wěn)定或緩慢進(jìn)展,骨骼肌活檢具有特征性病理改變。根據(jù)特征性病理表現(xiàn)分類(lèi):1)軸空性肌病(中央軸空病/多迷你軸空病,軸空結(jié)構(gòu));2)中心核肌病(中心核/肌管肌病);3)桿狀體肌病(桿狀體/軸空-桿體/帽狀體);4)肌球蛋白儲(chǔ)積病(胞漿異常沉積);5)肌纖維類(lèi)型不均等癥(選擇性I型肌纖維萎縮)。先天性肌病共同病理變化為:肌纖維直徑大小及類(lèi)型分布異常,胞漿內(nèi)存在病理性特殊結(jié)構(gòu);不同于肌營(yíng)養(yǎng)不良及代謝性肌病的是:少見(jiàn)變性、壞死及再生肌纖維,無(wú)糖原及脂肪成分蓄積。CMs遺傳方式復(fù)雜多樣,包括常染色體顯性遺傳(Autosomal dominant inheritance,AD)、常染色體隱性遺傳(Autosomal recessive inheritance,AR)、X連鎖隱性遺傳(X-linked recessive inheritance,XR)及散發(fā)多種遺傳方式,迄今為止發(fā)現(xiàn)30余種致病基因。CMs具有豐富的臨床/遺傳異質(zhì)性。每一類(lèi)先天性肌病均具遺傳異質(zhì)性,如桿狀體肌病由NEB、TPM2、TPM3、ACTA1、TNNT1、CFL2、KBTBD13、KLHL40和KLHL41等基因變異致病;軸空性肌病由RYR1、MYH7、SEPN1等基因變異致病;中心核肌病由MTM1、BIN1、DNM2、TTN基因變異致病;肌纖維類(lèi)型不均由TPM2、TPM3、RYR1、ACTA1、MYH7基因變異致病。臨床異質(zhì)性表現(xiàn)為:同一基因變異導(dǎo)致不同的病理現(xiàn)象,如RYR1變異可導(dǎo)致中央軸空病、迷你軸空病、中心核肌病、肌纖維類(lèi)型不均;ACTA1變異可導(dǎo)致桿狀體肌病(包括帽狀體肌病)、肌動(dòng)蛋白絲聚合病、肌纖維類(lèi)型不均。CMs臨床診斷面臨的問(wèn)題如下:1)臨床表型相似,造成CMs診斷困難;2)相同病理特點(diǎn)可由不同致病基因?qū)е?3)CMs與肌原纖維病致病基因重疊;4)某些致病基因外顯子數(shù)目巨大。復(fù)雜的臨床/遺傳異質(zhì)性使CMs的診斷必須基于致病基因分析;傳統(tǒng)的基于CMs骨骼肌病理活檢特定的結(jié)構(gòu)改變,可提示基因測(cè)序方向,但CMs上述臨床及遺傳學(xué)特點(diǎn),使用傳統(tǒng)sanger法基因分析在診斷陽(yáng)性率、鑒別診斷、分型診斷及診斷時(shí)效方面均存在局限性,桎梏了cms的分子生物學(xué)診斷廣泛應(yīng)用于臨床。目的基因捕獲二代測(cè)序(nextgenerationsequencing,ngs)技術(shù),能夠一次性對(duì)多個(gè)基因的全部外顯子捕獲、測(cè)序,堿基覆蓋度達(dá)到99%,對(duì)每一個(gè)堿基檢測(cè)平均重?cái)?shù)(測(cè)序深度)達(dá)100重以上,快速、準(zhǔn)確、一次性完成多個(gè)目的基因的外顯子測(cè)序,相比全外顯子及全基因組測(cè)序,其所用時(shí)間少、單堿基測(cè)序費(fèi)用低及生物信息分析相對(duì)簡(jiǎn)單,因此更多應(yīng)用于臨床。同時(shí)目的基因捕獲ngs技術(shù)學(xué)特點(diǎn),解決了sanger測(cè)序在cms分子生物學(xué)診斷中的不足,推動(dòng)cms分子生物學(xué)分型診斷及鑒別診斷。本研究從河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院骨骼肌遺傳資源標(biāo)本庫(kù)(2005.3-2015.12,1471例)篩選:1)中央軸空病(9例);2)中心核肌病(7例);進(jìn)行臨床、病理分析,目的基因捕獲ngs進(jìn)行致病基因篩查,生物信息學(xué)分析得出的位點(diǎn)經(jīng)患者及其無(wú)癥狀親屬(22例)sanger法驗(yàn)證。第一部分中央軸空病臨床、病理及基因分析目的:本部分基于臨床、活檢骨骼肌病理診斷,篩選9例中央軸空病(centralcoredisease,ccd)患者,采用軸空性肌病目的基因捕獲ngs技術(shù)、sanger驗(yàn)證,確定致病基因及突變類(lèi)型,分析、總結(jié)中國(guó)人群ccd臨床、病理及基因變異特點(diǎn),并探討目的基因捕獲ngs在ccd診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法:1臨床病例入選標(biāo)準(zhǔn):1)臨床表現(xiàn):嬰幼兒起病的緩慢進(jìn)展的四肢近端肌、腰帶肌無(wú)力、萎縮,伴/不伴骨骼肌外并發(fā)癥及面肌受累;2)ck正常或輕度升高,肌電圖呈肌源性損害或正常;3)活檢骨骼肌組織化學(xué)染色呈典型中央軸空結(jié)構(gòu),除外肌營(yíng)養(yǎng)不良改變,糖原、脂類(lèi)正常。2歸納整理入組患者臨床資料,包括:性別、發(fā)病年齡、血ck、電生理檢查結(jié)果,2例(病例1、7)行骨盆ct(computerizedtomography,ct)檢查。3活檢骨骼肌組織化學(xué),病理分析;4例患者(病例2、3、4、8)行電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)分析。4軸空性肌病目的基因富集(ryr1、myh7、sepn1)二代測(cè)序,生物信息學(xué)分析致病基因,對(duì)發(fā)現(xiàn)的突變應(yīng)用sanger法對(duì)患者(9例)及部分無(wú)癥狀親屬(9例)驗(yàn)證。結(jié)果:19例ccd患者中,男性3例,女性6例,陽(yáng)性家族史者3例,年齡2-32歲,全部為出生后或嬰幼兒期起病。臨床表現(xiàn)為輕-中度的非進(jìn)行性近端肌無(wú)力、肌張力低下;5例具有特殊容貌(高腭弓、倒v型嘴、細(xì)長(zhǎng)臉等),6例患者伴骨骼肌外并發(fā)癥(關(guān)節(jié)過(guò)伸展、跟腱攣縮等、脊柱側(cè)彎先天性髖關(guān)節(jié)脫位)。血ck輕度升高1例,正常8例。emg呈肌源性損害6例,正常3例。2例骨盆ct示髖臼發(fā)育不良及臀肌萎縮。2活檢骨骼肌組織化學(xué)染色(9例):肌纖維未見(jiàn)明顯變性、壞死和再生,肌纖維輕-中度大小不等,可見(jiàn)典型中央軸空結(jié)構(gòu),呈單個(gè)或多個(gè),位于肌纖維中央或偏側(cè)。所有病例均表現(xiàn)為i型肌纖維萎縮;肌纖維類(lèi)型分布:單一i型肌纖維5例,i型肌纖維優(yōu)勢(shì)4例。電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(4例):軸空區(qū)域肌纖維結(jié)構(gòu)紊亂,線粒體缺失。3目的基因捕獲ngs分析、sanger驗(yàn)證,8例患者致病基因?yàn)閞yr1,共發(fā)現(xiàn)5個(gè)雜合突變(新發(fā)突變2個(gè),已報(bào)位點(diǎn)3個(gè))。具體如下:3例新發(fā)突變(c.13732tg和c.13915_13923del),3例c.14582ga,1例c.14581ct,1例c.13919tg。其中2例ryr1為denovo突變(c.13919tg和c.13915_13923del)。1例(例6)于ryr1、myh7、sepn1均未發(fā)現(xiàn)具有臨床意義致病突變。結(jié)論:1ccd符合cms的一般臨床表現(xiàn)。2活檢骨骼肌病理分析,中央軸空是診斷與鑒別診斷其他類(lèi)型cms、兒童遺傳性骨骼肌疾病的重要方法。3ryr1可能為中國(guó)人ccd常見(jiàn)致病基因,可能存在外顯子94-101的附近熱點(diǎn)突變區(qū)域。4ngs對(duì)于發(fā)現(xiàn)ccd的ryr1以外基因變異具有篩查價(jià)值。第二部分中心核肌病臨床、病理及分子生物學(xué)分析目的:中心核肌病(centronuclearmyopathies,cnms)根據(jù)遺傳方式及臨床表現(xiàn)分為三類(lèi):xr遺傳(mtm1)、ad遺傳(dnm2、ccdc78等)及ar遺傳(bin1、ryr1等)。不同的類(lèi)型存在不同的臨床表現(xiàn)和不同的預(yù)后。其中女性mtm1變異攜帶者患者僅有個(gè)例報(bào)道,其發(fā)病機(jī)制可能與x染色體失活偏移(skewedx-chromosomeinactivation,sxci)有關(guān)。本部分篩選經(jīng)臨床、活檢骨骼肌病理診斷的cnms患者7例,使用中心核肌病目的基因捕獲ngs測(cè)序技術(shù),篩選致病基因,并對(duì)2例mtm1女性攜帶者進(jìn)行x染色體失活分析。總結(jié)不同亞型cnms臨床、下肢骨骼肌mri特點(diǎn)、骨骼肌病理特點(diǎn);確定一組中國(guó)人群cnms致病基因及突變類(lèi)型,總結(jié)基因變異特點(diǎn)。方法:1臨床病例入選標(biāo)準(zhǔn):1)臨床表現(xiàn):符合cms,包括嬰幼兒起病的緩慢進(jìn)行性加重肌無(wú)力、萎縮,運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩,伴/不伴骨骼肌外并發(fā)癥(關(guān)節(jié)攣縮、脊柱側(cè)彎)及面肌受累(細(xì)長(zhǎng)臉、高腭弓、眼外肌麻痹等);2)ck正�；蜉p度升高,肌電圖正�；虺始≡葱該p害;3)活檢骨骼肌組織化學(xué)染色中心核肌纖維比例增加,除外肌營(yíng)養(yǎng)不良改變,糖原、脂類(lèi)正常。2歸納整理入組患者臨床資料,包括:性別、發(fā)病年齡、血ck、電生理檢查結(jié)果,5例患者(病例2、3、4、6、7)行雙下肢骨骼肌核磁共振成像(magneticresonanceimaging,mri)檢查。3活檢骨骼肌組織化學(xué),病理分析;2例患者(病例1、7)行電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)分析。4中心核肌病目的基因捕獲(mtm1、dnm2、bin1、ryr1、ccdc78、ttn、speg、mtmr14)ngs測(cè)序,生物信息學(xué)分析致病基因,對(duì)發(fā)現(xiàn)的突變應(yīng)用sanger法對(duì)患者(7例)及無(wú)癥狀親屬(12例)家系驗(yàn)證。5x染色體失活(xchromosomeinactivation,xci)分析:2例mtm1變異的女性患者,pcr其外周血dna擴(kuò)增雄性激素受體(androgenreceptor,ar)基因第1外顯子cag重復(fù)序列的多肽性分析x染色體失活。x染色體失活時(shí),位于該重復(fù)序列附近的甲基化敏感性內(nèi)切酶hpaii的酶切位點(diǎn)被甲基化而不能被切斷,而有活性的x染色體則相反。因此,如先用hpaii對(duì)基因組dna酶切后再進(jìn)行pcr擴(kuò)增,僅有失活x染色體有產(chǎn)物。結(jié)果:17例cnms患者中,男性3例,女性4例,例1具陽(yáng)性家族史,其余患者無(wú)陽(yáng)性家族史。年齡3-47歲,均為生后或嬰幼兒期起病,病情緩慢進(jìn)展。3例(病例4、5、6)為遠(yuǎn)端肌無(wú)力為主要及首發(fā)癥狀,其余4例主要表現(xiàn)為四肢近端肌無(wú)力。5例具有特殊面容(細(xì)長(zhǎng)面容、高腭弓),3例伴眼外肌受累(眼瞼下垂、眼外肌麻痹),4例伴骨關(guān)節(jié)異常(脊柱側(cè)凸、跟腱攣縮、手指關(guān)節(jié)畸形及過(guò)伸展);ck正常6例,升高1例;emg呈肌源性改變。下肢骨骼肌mri:例4、6為小腿重于大腿,例2、3、7大腿重于小腿。其中例4、6大腿前群肌(股中間肌)重于后群,而小腿以后群肌受累為主(比目魚(yú)肌);例3、7大腿后群肌受累重于前群,小腿以腓腸肌及脛骨前肌輕度受累;例3小腿肌群無(wú)明顯受累。2活檢骨骼肌組織化學(xué)染色(7例):未見(jiàn)明顯肌纖維變性、壞死和再生,肌纖維大小不等,脂肪結(jié)締組織輕-重度增生(例2彌漫性脂肪浸潤(rùn))。中心核及核集中肌纖維顯著增加;i型肌纖維小徑化,2例為i型肌纖維優(yōu)勢(shì),2例為單一i型肌纖維,其中mtm1-cnm(例1)可見(jiàn)項(xiàng)圈纖維,dnm2-cnm(例4、5、6)及ryr1-cnm(例7)可見(jiàn)輪輻狀肌纖維(radialsarcoplasmicstrands,rss)。電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(2例):可見(jiàn)中心核呈鏈狀排列,中心核周邊區(qū)域線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、糖原顆粒聚集。3目的基因捕獲ngs測(cè)序、sanger驗(yàn)證,病例1、2、3為mtm1變異(分別為c.1054-1ga、c.286dupa、c.1405cg);病例4、5、6為dnm2變異(分別為c.1106ga、c.1102ga、c.1105ct);例7為ryr1變異(c.12237delc、c.12536ga),其中mtm1(c.1405cg)及ryr1(c.12237delc)為新發(fā)突變,病例4、5為denovo突變。根據(jù)基因分析結(jié)果,將7例患者分型診斷:病例1、2、3為mtm1變異x連鎖隱性遺傳肌管疾病(x-linkedrecessivemyotubularmyopathy,xlmtm),病例4、5、6為dnm2變異的常染色體顯性遺傳cnm,病例7為ryr1變異常染色體隱性遺傳CNM。4病例1和2X染色體失活分析:XCI80%(病例1XCI傾斜率為84:16,病例2XCI傾斜率為83:17),為SXCI。結(jié)論:1 CNMsCNMs表型相似,臨床不能明確分型診斷;DNM2-CNM具有相對(duì)一致的臨床表型,表現(xiàn)為下肢遠(yuǎn)端為重的肌無(wú)力,有待進(jìn)一步增加樣本量研究。2特征性骨骼肌受累肌群,一定程度上提示CNMs亞型,指導(dǎo)致病基因測(cè)序方向,同時(shí)可以進(jìn)一步指導(dǎo)骨骼肌活檢部位。3中心核肌纖維明顯增多是特征性病理改變,對(duì)CNMs與其他類(lèi)型CMs及其他遺傳性骨骼肌疾病的具有診斷、鑒別診斷價(jià)值。4 CNMs多個(gè)基因、點(diǎn)突變致病,應(yīng)將CNMs視為一疾病譜系,臨床表型相似、高度遺傳異質(zhì)性,建議基因分析首選NGS,一次性完成診斷與鑒別診斷。5 MTM1變異的女性攜帶者能夠發(fā)病并有較嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)及典型中心核病理特點(diǎn),癥狀較男性患者輕,可能與SXCI有關(guān),女性XLMTM攜帶必要時(shí)應(yīng)行XCI分析。6 CNMs高度致殘,正確的分子生物學(xué)診斷可使先證者及其家系獲得正確的遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷,避免出生缺陷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R746

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本文編號(hào)：2436443