【摘要】：先天性肌病(Congenital myopathies,CMs)是一組單基因遺傳性骨骼肌疾病,臨床多以新生兒/幼年起病肌無力,伴/不伴肌張力低下,病情穩(wěn)定或緩慢進展,骨骼肌活檢具有特征性病理改變。根據(jù)特征性病理表現(xiàn)分類:1)軸空性肌病(中央軸空病/多迷你軸空病,軸空結構);2)中心核肌病(中心核/肌管肌病);3)桿狀體肌病(桿狀體/軸空-桿體/帽狀體);4)肌球蛋白儲積病(胞漿異常沉積);5)肌纖維類型不均等癥(選擇性I型肌纖維萎縮)。先天性肌病共同病理變化為:肌纖維直徑大小及類型分布異常,胞漿內(nèi)存在病理性特殊結構;不同于肌營養(yǎng)不良及代謝性肌病的是:少見變性、壞死及再生肌纖維,無糖原及脂肪成分蓄積。CMs遺傳方式復雜多樣,包括常染色體顯性遺傳(Autosomal dominant inheritance,AD)、常染色體隱性遺傳(Autosomal recessive inheritance,AR)、X連鎖隱性遺傳(X-linked recessive inheritance,XR)及散發(fā)多種遺傳方式,迄今為止發(fā)現(xiàn)30余種致病基因。CMs具有豐富的臨床/遺傳異質(zhì)性。每一類先天性肌病均具遺傳異質(zhì)性,如桿狀體肌病由NEB、TPM2、TPM3、ACTA1、TNNT1、CFL2、KBTBD13、KLHL40和KLHL41等基因變異致病;軸空性肌病由RYR1、MYH7、SEPN1等基因變異致病;中心核肌病由MTM1、BIN1、DNM2、TTN基因變異致病;肌纖維類型不均由TPM2、TPM3、RYR1、ACTA1、MYH7基因變異致病。臨床異質(zhì)性表現(xiàn)為:同一基因變異導致不同的病理現(xiàn)象,如RYR1變異可導致中央軸空病、迷你軸空病、中心核肌病、肌纖維類型不均;ACTA1變異可導致桿狀體肌病(包括帽狀體肌病)、肌動蛋白絲聚合病、肌纖維類型不均。CMs臨床診斷面臨的問題如下:1)臨床表型相似,造成CMs診斷困難;2)相同病理特點可由不同致病基因?qū)е?3)CMs與肌原纖維病致病基因重疊;4)某些致病基因外顯子數(shù)目巨大。復雜的臨床/遺傳異質(zhì)性使CMs的診斷必須基于致病基因分析;傳統(tǒng)的基于CMs骨骼肌病理活檢特定的結構改變,可提示基因測序方向,但CMs上述臨床及遺傳學特點,使用傳統(tǒng)sanger法基因分析在診斷陽性率、鑒別診斷、分型診斷及診斷時效方面均存在局限性,桎梏了cms的分子生物學診斷廣泛應用于臨床。目的基因捕獲二代測序(nextgenerationsequencing,ngs)技術,能夠一次性對多個基因的全部外顯子捕獲、測序,堿基覆蓋度達到99%,對每一個堿基檢測平均重數(shù)(測序深度)達100重以上,快速、準確、一次性完成多個目的基因的外顯子測序,相比全外顯子及全基因組測序,其所用時間少、單堿基測序費用低及生物信息分析相對簡單,因此更多應用于臨床。同時目的基因捕獲ngs技術學特點,解決了sanger測序在cms分子生物學診斷中的不足,推動cms分子生物學分型診斷及鑒別診斷。本研究從河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院骨骼肌遺傳資源標本庫(2005.3-2015.12,1471例)篩選:1)中央軸空病(9例);2)中心核肌病(7例);進行臨床、病理分析,目的基因捕獲ngs進行致病基因篩查,生物信息學分析得出的位點經(jīng)患者及其無癥狀親屬(22例)sanger法驗證。第一部分中央軸空病臨床、病理及基因分析目的:本部分基于臨床、活檢骨骼肌病理診斷,篩選9例中央軸空病(centralcoredisease,ccd)患者,采用軸空性肌病目的基因捕獲ngs技術、sanger驗證,確定致病基因及突變類型,分析、總結中國人群ccd臨床、病理及基因變異特點,并探討目的基因捕獲ngs在ccd診斷中的應用價值。方法:1臨床病例入選標準:1)臨床表現(xiàn):嬰幼兒起病的緩慢進展的四肢近端肌、腰帶肌無力、萎縮,伴/不伴骨骼肌外并發(fā)癥及面肌受累;2)ck正常或輕度升高,肌電圖呈肌源性損害或正常;3)活檢骨骼肌組織化學染色呈典型中央軸空結構,除外肌營養(yǎng)不良改變,糖原、脂類正常。2歸納整理入組患者臨床資料,包括:性別、發(fā)病年齡、血ck、電生理檢查結果,2例(病例1、7)行骨盆ct(computerizedtomography,ct)檢查。3活檢骨骼肌組織化學,病理分析;4例患者(病例2、3、4、8)行電子顯微鏡超微結構分析。4軸空性肌病目的基因富集(ryr1、myh7、sepn1)二代測序,生物信息學分析致病基因,對發(fā)現(xiàn)的突變應用sanger法對患者(9例)及部分無癥狀親屬(9例)驗證。結果:19例ccd患者中,男性3例,女性6例,陽性家族史者3例,年齡2-32歲,全部為出生后或嬰幼兒期起病。臨床表現(xiàn)為輕-中度的非進行性近端肌無力、肌張力低下;5例具有特殊容貌(高腭弓、倒v型嘴、細長臉等),6例患者伴骨骼肌外并發(fā)癥(關節(jié)過伸展、跟腱攣縮等、脊柱側彎先天性髖關節(jié)脫位)。血ck輕度升高1例,正常8例。emg呈肌源性損害6例,正常3例。2例骨盆ct示髖臼發(fā)育不良及臀肌萎縮。2活檢骨骼肌組織化學染色(9例):肌纖維未見明顯變性、壞死和再生,肌纖維輕-中度大小不等,可見典型中央軸空結構,呈單個或多個,位于肌纖維中央或偏側。所有病例均表現(xiàn)為i型肌纖維萎縮;肌纖維類型分布:單一i型肌纖維5例,i型肌纖維優(yōu)勢4例。電子顯微鏡超微結構特點(4例):軸空區(qū)域肌纖維結構紊亂,線粒體缺失。3目的基因捕獲ngs分析、sanger驗證,8例患者致病基因為ryr1,共發(fā)現(xiàn)5個雜合突變(新發(fā)突變2個,已報位點3個)。具體如下:3例新發(fā)突變(c.13732tg和c.13915_13923del),3例c.14582ga,1例c.14581ct,1例c.13919tg。其中2例ryr1為denovo突變(c.13919tg和c.13915_13923del)。1例(例6)于ryr1、myh7、sepn1均未發(fā)現(xiàn)具有臨床意義致病突變。結論:1ccd符合cms的一般臨床表現(xiàn)。2活檢骨骼肌病理分析,中央軸空是診斷與鑒別診斷其他類型cms、兒童遺傳性骨骼肌疾病的重要方法。3ryr1可能為中國人ccd常見致病基因,可能存在外顯子94-101的附近熱點突變區(qū)域。4ngs對于發(fā)現(xiàn)ccd的ryr1以外基因變異具有篩查價值。第二部分中心核肌病臨床、病理及分子生物學分析目的:中心核肌病(centronuclearmyopathies,cnms)根據(jù)遺傳方式及臨床表現(xiàn)分為三類:xr遺傳(mtm1)、ad遺傳(dnm2、ccdc78等)及ar遺傳(bin1、ryr1等)。不同的類型存在不同的臨床表現(xiàn)和不同的預后。其中女性mtm1變異攜帶者患者僅有個例報道,其發(fā)病機制可能與x染色體失活偏移(skewedx-chromosomeinactivation,sxci)有關。本部分篩選經(jīng)臨床、活檢骨骼肌病理診斷的cnms患者7例,使用中心核肌病目的基因捕獲ngs測序技術,篩選致病基因,并對2例mtm1女性攜帶者進行x染色體失活分析。總結不同亞型cnms臨床、下肢骨骼肌mri特點、骨骼肌病理特點;確定一組中國人群cnms致病基因及突變類型,總結基因變異特點。方法:1臨床病例入選標準:1)臨床表現(xiàn):符合cms,包括嬰幼兒起病的緩慢進行性加重肌無力、萎縮,運動發(fā)育遲緩,伴/不伴骨骼肌外并發(fā)癥(關節(jié)攣縮、脊柱側彎)及面肌受累(細長臉、高腭弓、眼外肌麻痹等);2)ck正�；蜉p度升高,肌電圖正常或呈肌源性損害;3)活檢骨骼肌組織化學染色中心核肌纖維比例增加,除外肌營養(yǎng)不良改變,糖原、脂類正常。2歸納整理入組患者臨床資料,包括:性別、發(fā)病年齡、血ck、電生理檢查結果,5例患者(病例2、3、4、6、7)行雙下肢骨骼肌核磁共振成像(magneticresonanceimaging,mri)檢查。3活檢骨骼肌組織化學,病理分析;2例患者(病例1、7)行電子顯微鏡超微結構分析。4中心核肌病目的基因捕獲(mtm1、dnm2、bin1、ryr1、ccdc78、ttn、speg、mtmr14)ngs測序,生物信息學分析致病基因,對發(fā)現(xiàn)的突變應用sanger法對患者(7例)及無癥狀親屬(12例)家系驗證。5x染色體失活(xchromosomeinactivation,xci)分析:2例mtm1變異的女性患者,pcr其外周血dna擴增雄性激素受體(androgenreceptor,ar)基因第1外顯子cag重復序列的多肽性分析x染色體失活。x染色體失活時,位于該重復序列附近的甲基化敏感性內(nèi)切酶hpaii的酶切位點被甲基化而不能被切斷,而有活性的x染色體則相反。因此,如先用hpaii對基因組dna酶切后再進行pcr擴增,僅有失活x染色體有產(chǎn)物。結果:17例cnms患者中,男性3例,女性4例,例1具陽性家族史,其余患者無陽性家族史。年齡3-47歲,均為生后或嬰幼兒期起病,病情緩慢進展。3例(病例4、5、6)為遠端肌無力為主要及首發(fā)癥狀,其余4例主要表現(xiàn)為四肢近端肌無力。5例具有特殊面容(細長面容、高腭弓),3例伴眼外肌受累(眼瞼下垂、眼外肌麻痹),4例伴骨關節(jié)異常(脊柱側凸、跟腱攣縮、手指關節(jié)畸形及過伸展);ck正常6例,升高1例;emg呈肌源性改變。下肢骨骼肌mri:例4、6為小腿重于大腿,例2、3、7大腿重于小腿。其中例4、6大腿前群肌(股中間肌)重于后群,而小腿以后群肌受累為主(比目魚肌);例3、7大腿后群肌受累重于前群,小腿以腓腸肌及脛骨前肌輕度受累;例3小腿肌群無明顯受累。2活檢骨骼肌組織化學染色(7例):未見明顯肌纖維變性、壞死和再生,肌纖維大小不等,脂肪結締組織輕-重度增生(例2彌漫性脂肪浸潤)。中心核及核集中肌纖維顯著增加;i型肌纖維小徑化,2例為i型肌纖維優(yōu)勢,2例為單一i型肌纖維,其中mtm1-cnm(例1)可見項圈纖維,dnm2-cnm(例4、5、6)及ryr1-cnm(例7)可見輪輻狀肌纖維(radialsarcoplasmicstrands,rss)。電子顯微鏡超微結構特點(2例):可見中心核呈鏈狀排列,中心核周邊區(qū)域線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復合體、糖原顆粒聚集。3目的基因捕獲ngs測序、sanger驗證,病例1、2、3為mtm1變異(分別為c.1054-1ga、c.286dupa、c.1405cg);病例4、5、6為dnm2變異(分別為c.1106ga、c.1102ga、c.1105ct);例7為ryr1變異(c.12237delc、c.12536ga),其中mtm1(c.1405cg)及ryr1(c.12237delc)為新發(fā)突變,病例4、5為denovo突變。根據(jù)基因分析結果,將7例患者分型診斷:病例1、2、3為mtm1變異x連鎖隱性遺傳肌管疾病(x-linkedrecessivemyotubularmyopathy,xlmtm),病例4、5、6為dnm2變異的常染色體顯性遺傳cnm,病例7為ryr1變異常染色體隱性遺傳CNM。4病例1和2X染色體失活分析:XCI80%(病例1XCI傾斜率為84:16,病例2XCI傾斜率為83:17),為SXCI。結論:1 CNMsCNMs表型相似,臨床不能明確分型診斷;DNM2-CNM具有相對一致的臨床表型,表現(xiàn)為下肢遠端為重的肌無力,有待進一步增加樣本量研究。2特征性骨骼肌受累肌群,一定程度上提示CNMs亞型,指導致病基因測序方向,同時可以進一步指導骨骼肌活檢部位。3中心核肌纖維明顯增多是特征性病理改變,對CNMs與其他類型CMs及其他遺傳性骨骼肌疾病的具有診斷、鑒別診斷價值。4 CNMs多個基因、點突變致病,應將CNMs視為一疾病譜系,臨床表型相似、高度遺傳異質(zhì)性,建議基因分析首選NGS,一次性完成診斷與鑒別診斷。5 MTM1變異的女性攜帶者能夠發(fā)病并有較嚴重的臨床表現(xiàn)及典型中心核病理特點,癥狀較男性患者輕,可能與SXCI有關,女性XLMTM攜帶必要時應行XCI分析。6 CNMs高度致殘,正確的分子生物學診斷可使先證者及其家系獲得正確的遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷,避免出生缺陷。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R746

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本文編號：2436443