【摘要】：一、目的： RIZ1基因定位于人染色體1p36(1)。RIZ基因編碼兩種蛋白，即RIZ1和RIZ2。RIZ1氨基末端比RIZ2多一個PR結(jié)構(gòu)域。 RIZ1具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，可以通過促進組蛋白H3上的賴氨酸甲基化(2-4)。在乳腺癌、直腸癌和肝癌細(xì)胞株中上調(diào)RIZ1的表達(dá)，可以發(fā)現(xiàn)腫瘤增殖明顯減緩(4-8)。在前面的試驗中，我們應(yīng)用組織芯片檢測RIZ1在腦膜瘤中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RIZ1在惡性腦膜瘤中表達(dá)甚少。重要的是，在體外試驗中，惡性腦膜瘤IOMM-LEE細(xì)胞株中過表達(dá)RIZ1可以使其生長受到顯著抑制，并出現(xiàn)G2/M期細(xì)胞周期阻滯；RIZ1蛋白在惡性腦膜瘤細(xì)胞中的表達(dá)與c-Myc呈負(fù)關(guān)聯(lián)表達(dá)，在腦膜瘤細(xì)胞株中過表達(dá)RIZ1，可以下調(diào)c-Myc的表達(dá)，上述研究結(jié)果已經(jīng)發(fā)表于雜志《Oncogene》(9)。 根據(jù)以上研究成果，RIZ1表達(dá)兩種蛋白RIZ1和RIZ2，其區(qū)別是RIZ1比RIZ2氨基末端多了200個氨基酸（即PR-domain），其余序列相同。RIZ1對于惡性腦膜瘤具有腫瘤抑制作用，那么PR domain是否能夠單獨產(chǎn)生這種腫瘤抑制作用？如果能夠起作用，那么對于不同級別腦膜瘤細(xì)胞作用效果是否一樣？可能的機制是什么？我們在本實驗中對這一問題進行了研究與陳述。 二、方法： 首先我們利用不同級別腦膜瘤手術(shù)切除標(biāo)本培養(yǎng)腦膜瘤原代細(xì)胞，并進行腦膜瘤原代細(xì)胞的鑒定及RIZ1的表達(dá)水平的檢測，然后，我們利用HIV-TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，此系統(tǒng)可以將目的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)入目的細(xì)胞內(nèi)，并發(fā)揮所連接的目的蛋白的生物學(xué)作用，而TAT蛋白本身對于細(xì)胞沒有毒性作用，，將TAT蛋白作用腦膜瘤原代細(xì)胞后，我們檢測了不同給藥濃度與給藥時間的腦膜瘤原代細(xì)胞增殖及凋亡情況，在抑癌機制研究中，我們首先注意到RIZ1是甲基化轉(zhuǎn)移酶家族8（KMT8）成員，它可以通過甲基化組蛋白H3第九位賴氨酸來調(diào)控下游相關(guān)分子的表達(dá)。在其他的腫瘤中，可以觀察到1位/2位/3位的賴氨酸甲基化，我們通過表達(dá)譜芯片及甲基化分子靶標(biāo)的檢測探究TAT-PR domain蛋白腫瘤抑制活性的可能分子機制。最后我們在腦膜瘤手術(shù)切除標(biāo)本中通過免疫組化方法檢測RIZ1表達(dá)量是否真實存在差異趨勢。 三、結(jié)果： 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在腦膜瘤原代細(xì)胞中，RIZ1隨腦膜瘤級別的升高而降低，癌基因c-Myc隨腦膜瘤級別的升高而表達(dá)量增高，TAT-PR domain能夠使高級別腦膜瘤原代細(xì)胞增殖受到明顯抑制，并且促進高級別腦膜瘤原代細(xì)胞的凋亡，在本實驗中我們觀察到WHOIII級腦膜瘤原代細(xì)胞蛋白處理組出現(xiàn)：1、H3K91位及2位的甲基化，2、c-Myc表達(dá)水平降低�；虮磉_(dá)芯片中我們繪制了蛋白處理后隨時間改變?nèi)虮磉_(dá)調(diào)控圖譜，發(fā)現(xiàn)數(shù)個與腫瘤增殖，細(xì)胞周期相關(guān)的分子表達(dá)量發(fā)生改變。在腦膜瘤手術(shù)切除標(biāo)本中，雖然標(biāo)本量不多，但是仍可以觀察到RIZ1隨腦膜瘤級別升高而表達(dá)量下降的趨勢。 四、結(jié)論： TAT-PR domain蛋白能夠使高級別腦膜瘤原代細(xì)胞增殖受到明顯抑制，并且促進細(xì)胞的凋亡，這種腫瘤抑制效應(yīng)在在體實驗中也再一次被驗證。這種腫瘤抑制作用可能是建立在高級別腦膜瘤中低表達(dá)RIZ1的基礎(chǔ)之上。這種腫瘤抑制效應(yīng)可能是通過PR-domain的甲基化轉(zhuǎn)移酶活性調(diào)節(jié)下游c-Myc等腫瘤增殖凋亡相關(guān)分子而實現(xiàn)的。 本實驗共分為八個部分：第一部分：腦膜瘤原代細(xì)胞的培養(yǎng)。第二部分：RIZ1在不同級別腦膜瘤原代細(xì)胞中的表達(dá)研究。第三部分：可轉(zhuǎn)導(dǎo)PR domain蛋白的構(gòu)建。第四部分：PR對腦膜瘤原代細(xì)胞增殖和凋亡的影響。第五部分：PR domain經(jīng)H3K9甲基化途徑影響腦膜瘤原代細(xì)胞增殖凋亡的研究。第六部分：全基因譜表達(dá)芯片探討PR domain的下游作用分子。第七部分：不同級別腦膜瘤手術(shù)切除標(biāo)本驗證RIZ1表達(dá)量改變。 第一部分、腦膜瘤原代細(xì)胞的培養(yǎng) 1、目的：培養(yǎng)不同級別的腦膜瘤原代細(xì)胞，為后續(xù)的實驗提供實驗的載體。 2、方法：手術(shù)切除腦膜瘤后，取壞死較少，結(jié)構(gòu)較完整的瘤體部分，使用不含血清的DMEM冰盒迅速轉(zhuǎn)運，在30分鐘內(nèi)\是原代培養(yǎng)操作，使用不含血清的PBS緩沖液洗去腫瘤組織塊表面的血液及雜質(zhì)，在體視顯微鏡下，使用顯微手術(shù)器械去除瘤體中血管及壞死組織，放置于少量PBS中，于3.5cm培養(yǎng)皿冰上進行剪碎操作，剪至1×1mm左右，加入與瘤體體積相當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌�，及少量DNA酶，將組織塊置于37攝氏度孵箱中進行消化，原代細(xì)胞的消化總時間為30分鐘，并且每五分鐘需要震蕩一次培養(yǎng)皿。消化完成后，使用2倍體積的含10%FBS的血清培養(yǎng)基中和胰酶，吹打后，分別經(jīng)70微米和40微米細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，將獲得的細(xì)胞以900rpm/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，重懸后，使用細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，以5×106/ml的細(xì)胞濃度種于10cm培養(yǎng)皿中，37攝氏度，5%CO2濃度進行培養(yǎng)，每2日換液，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合度時，0.125%胰酶消化后進行傳代操作。 3、結(jié)果：經(jīng)前期標(biāo)本采集，原代細(xì)胞培養(yǎng)，我們獲得了4例腦膜瘤原代細(xì)胞，按2007WHO分級標(biāo)準(zhǔn)，1級腦膜瘤1例，2級腦膜瘤2例，3級腦膜瘤1例，4例原代細(xì)胞均生長旺盛，腦膜瘤形態(tài)多為雙極或多級的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，良性腦膜瘤多傳至第10代，隨代數(shù)的增加，細(xì)胞的胞體逐漸增大，形態(tài)不規(guī)則，增殖速度明顯減慢，而惡性腦膜瘤細(xì)胞可增殖更多代，我們?nèi)?-5代的原代細(xì)胞用于進行后續(xù)的實驗。 4、結(jié)論：經(jīng)原代培養(yǎng)，我們獲得1級腦膜瘤原代細(xì)胞1例，2級腦膜瘤原代細(xì)胞2例，3級腦膜瘤原代細(xì)胞1例。 第二部分、RIZ1在不同級別腦膜瘤原代細(xì)胞中的表達(dá)研究 1、目的：檢測4例腦膜瘤原代細(xì)胞中內(nèi)源性RIZ1的表達(dá)量是否存在差異。 2、方法：首先，為了確定RIZ1在細(xì)胞中的定位，以及驗證所使用RIZ1抗體的特異性。我們進行了RIZ1抗體鑒定實驗，即首先利用RIZ1全長cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞293T，使RIZ1瞬時表達(dá)量增加，RIZ1免疫熒光檢測其具體細(xì)胞內(nèi)定位。 4例腦膜瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)至第三代，采用2種方法，即免疫熒光與免疫印記，檢測4例原代細(xì)胞中RIZ1與c-Myc的表達(dá)量改變。 3、結(jié)果：RIZ1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗中，我們發(fā)現(xiàn)RIZ1蛋白主要定位于細(xì)胞核，免疫熒光及蛋白印跡的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨腦膜瘤級別的升高，RIZ1的表達(dá)量下降，c-Myc的表達(dá)量上升，在3級腦膜瘤中RIZ1缺失表達(dá)。 4、結(jié)論：在4例腦膜瘤原代細(xì)胞中，RIZ1蛋白隨腦膜瘤級別的升高而表達(dá)下降，c-Myc與其表達(dá)趨勢相反。 第三部分、可轉(zhuǎn)導(dǎo)PR domain蛋白的構(gòu)建 1、目的：為了驗證PR domain對于腦膜瘤細(xì)胞是否單獨具有抗腫瘤作用，我們需構(gòu)建可穿膜的PR domain蛋白 2、方法：我們選用TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)將我們所需要的目的蛋白轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞中。首先經(jīng)PCR擴增和基因克隆技術(shù)，我們將PR domain單獨擴增出來，并且經(jīng)NcoI和EcoRI雙酶切連接到pTAT-HA表達(dá)載體上，得到融合質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DE3感受態(tài)細(xì)菌，并將細(xì)菌大量擴增，并誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，經(jīng)蛋白純化后得到所需的目的蛋白，蛋白凝膠電泳觀察目的蛋白分子量與純度，BCA定量目的蛋白的濃度，凍存與-80℃。 3、結(jié)果：經(jīng)質(zhì)粒構(gòu)建與蛋白純化步奏，我們獲得了所需的目的蛋白，經(jīng)蛋白電泳，我們觀察到目的蛋白分子量約32KD. 4、結(jié)論：我們將PR domain成功連接于TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中。 第四部分、PR對腦膜瘤原代細(xì)胞增殖和凋亡的影響 1、目的：驗證可轉(zhuǎn)導(dǎo)的PR domain對于腦膜瘤原代細(xì)胞是否具有抗腫瘤作用。 2、方法：首先我們以0.2μM的蛋白濃度處理腦膜瘤原代細(xì)胞2小時，行HA-tag免疫熒光染色，驗證轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白在細(xì)胞的定位情況，在繪制增殖曲線試驗中，我們選取了5種蛋白濃度（0、0.05、0.1、0.2、0.4μM）對4例原代細(xì)胞進行處理，繪制6天的生長曲線，在繪制生長曲線同時，我們對各組細(xì)胞進行了增殖靶標(biāo)ki67和PCNA的免疫熒光檢測，在凋亡試驗中，我們用0.4μM的給藥濃度處理腦膜瘤細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測24小時的細(xì)胞凋亡比例。 3、結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白主要定位于腦膜瘤原代細(xì)胞的胞核，細(xì)胞增殖實驗，細(xì)胞增殖靶標(biāo)檢測試驗以及凋亡實驗均得到類似的結(jié)果，即轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白對于高級別腦膜瘤的作用效果，明顯優(yōu)于低級別腦膜瘤，在實驗中我們發(fā)現(xiàn)了幾個值得深入研究的現(xiàn)象：1、轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白對于3級的腦膜瘤原代細(xì)胞的抗增殖促凋亡的作用效果最明顯，而對1級的腦膜瘤無明顯的抗腫瘤作用，對于2級腦膜瘤的作用介于兩者之間。2、2例2級腦膜瘤原代細(xì)胞中，轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白對于M12的作用效果優(yōu)于M11，而前面的實驗中我們發(fā)現(xiàn)M12的內(nèi)源性RIZ1表達(dá)量明顯低于M11。3、增殖靶標(biāo)ki67與PCNA的表達(dá)水平支持四例腦膜瘤原代細(xì)胞增殖曲線的趨勢。 4、結(jié)論：PR domain可單獨對高級別腦膜瘤原代細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤作用。 第五部分、PR domain經(jīng)H3K9甲基化途徑影響腦膜瘤原代細(xì)胞增殖凋亡的研究 1、目的：在前面的試驗中，我們發(fā)現(xiàn)可轉(zhuǎn)導(dǎo)的PR domain蛋白對于高級別腦膜瘤細(xì)胞具有腫瘤抑制作用，而其作用機制有待進一步的研究，RIZ1屬組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶8的家族成員，它可以甲基化組蛋白H3的第九位賴氨酸，調(diào)節(jié)下游分子通路的相關(guān)分子表達(dá)，PR domain作為RIZ1抑癌作用的重要功能結(jié)構(gòu)域是否具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性，需實驗驗證。 2、方法：使用0.4μM的蛋白給藥濃度，處理3級的腦膜瘤原代細(xì)胞，處理時間分別為0小時，4小時和12小時，提取各組細(xì)胞的蛋白后，免疫印記實驗檢測甲基化組蛋白表達(dá)量的改變，即H3K9me1(組蛋白H3第九位賴氨酸發(fā)生一甲基化)，H3K9me2(發(fā)生二甲基化)，H3K9me3(發(fā)生三甲基化)。同時我們檢測了隨時間改變，c-Myc的表達(dá)量改變，以及內(nèi)源性RIZ1的表達(dá)量改變。 3、結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)，隨時間的發(fā)展，H3K9me1及H3K9me2的表達(dá)量明顯升高，而c-Myc的表達(dá)量逐漸減低，RIZ1及H3K9me3的表達(dá)量無明顯的變化趨勢。 4、結(jié)論：試驗中我們觀察到隨組蛋白H3第九位賴氨酸1位及2位甲基化量的增加，c-Myc的表達(dá)量逐漸下降，考慮存在如下的信號通路，即RIZ1的PR domain功能結(jié)構(gòu)域自身或與其它分子協(xié)同促使H3K9發(fā)生1位及2位甲基化，甲基化的H3K9通過調(diào)節(jié)c-Myc的表達(dá)量進而調(diào)節(jié)相應(yīng)下游分子的表達(dá)。最終引起對高級別腦膜瘤的腫瘤抑制作用。 第六部分、全基因譜表達(dá)芯片探討PR domain的下游作用分子 1、目的：在前一步中，我們發(fā)現(xiàn)PR domain能夠通過組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性促使下游分子c-Myc的表達(dá)改變，除此通路外，是否還有其他的調(diào)節(jié)途徑，我們通過全基因譜表達(dá)芯片來進行研究。 2、方法：我們以0.4μM的蛋白濃度處理3級的腦膜瘤原代細(xì)胞，處理時間分別為0小時，4小時，12小時，24小時和48小時，同時設(shè)立的對照組給予等體積的PBS處理，鏡下拍照后，提取總RNA，送檢，行全基因表達(dá)譜檢測。 3、結(jié)果：形態(tài)觀察中我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，3級的腦膜瘤原代細(xì)胞形態(tài)由典型規(guī)則的多邊形向菱形演變，而其細(xì)胞觸角也有延長的現(xiàn)象，全基因表達(dá)譜結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨時間的進展，發(fā)生改變的基因數(shù)目也進行性地增加，其中包含有抑癌基因及細(xì)胞周期蛋白表達(dá)量的改變。 4、結(jié)論：可轉(zhuǎn)導(dǎo)的PR domain蛋白可能促使一系列的抑癌基因表達(dá)量的增加，以及細(xì)胞周期蛋白的變化，其中間過程可能是由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性介導(dǎo)實現(xiàn)的，是否存在其他的調(diào)節(jié)機制即通路，有待我們進一步的研究。 第七部分、不同級別腦膜瘤手術(shù)切除標(biāo)本驗證RIZ1的表達(dá)量改變 1、目的：從前面的試驗中我們得知，可轉(zhuǎn)導(dǎo)的PR domain對于高級別腦膜瘤腫瘤抑制作用是建立在高級別腦膜瘤低表達(dá)RIZ1的基礎(chǔ)上的，而在臨床上，高級別腦膜瘤細(xì)胞是否存在RIZ1表達(dá)量降低的趨勢呢？此問題我們在本部分實驗中進行了研究。 2、方法：收集不同級別的腦膜瘤手術(shù)切除標(biāo)本，免疫組化檢測標(biāo)本中RIZ1與c-Myc的表達(dá)量變化。 3、結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)隨腦膜瘤級別的升高，RIZ1的表達(dá)有下降趨勢，這與我們前期的研究結(jié)果不謀而合。 4、結(jié)論：高級別腦膜瘤中RIZ1低表達(dá)。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.45

【參考文獻(xiàn)】

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1 胡德志;王曉梅;毛穎;周良輔;;人橫紋肌樣腦膜瘤細(xì)胞株的分離和鑒定[J];中國神經(jīng)精神疾病雜志;2011年06期

本文編號：2436262