【摘要】：研究目的：顱內(nèi)動脈瘤破裂導(dǎo)致的蛛網(wǎng)膜下腔出血(aSAH, aneurysmal subarachnoid hemorrhage)是全世界范圍內(nèi)導(dǎo)致病患致死、致殘的最主要原因之一。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization)的流行病學(xué)調(diào)查研究表明,我國aSAH的年發(fā)病率在2/100000,美國2003年的流行病學(xué)資料顯示全美aSAH發(fā)病率在9.7/100000。aSAH發(fā)病兇險,入院前死亡率可高達(dá)12%-15%,約1/3的患者在首次發(fā)病時死亡；若破裂動脈瘤不經(jīng)外科夾閉或介入栓塞處理,幸存患者的6個月內(nèi)再出血死亡率高達(dá)50%,十年再出血死亡率則高達(dá)60%-80%。1992年以前,美國全國因aSAH入院的患者的年治療費(fèi)用就已高達(dá)1,755,600,000美金。由此可見,aSAH不但是威脅人類生命健康的一類嚴(yán)重疾病,而且發(fā)病后對家庭及社會都可以產(chǎn)生嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此,從顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生與發(fā)展的病理過程入手,研究其發(fā)病的分子和細(xì)胞機(jī)制并探索新的治療靶點(diǎn),特別是無創(chuàng)或微創(chuàng)的治療(如藥物治療),以預(yù)防或逆轉(zhuǎn)動脈瘤的轉(zhuǎn)歸,不僅可以降低腦動脈瘤的殘死率、提高生活質(zhì)量,也成為公眾衛(wèi)生保健的一大需求。本課題旨在初步闡明顱內(nèi)動脈瘤的血流動力學(xué)-生物學(xué)機(jī)制,初步驗(yàn)證KCa3.1是否為感知有害生物學(xué)應(yīng)力并作出生物分子反應(yīng)的靶點(diǎn),為阻斷動脈瘤發(fā)生,逆轉(zhuǎn)動脈瘤進(jìn)程,探索無創(chuàng)或藥物治療顱內(nèi)動脈瘤提供重要參考。研究方法：結(jié)扎大鼠一側(cè)頸總動脈及對側(cè)頸外動脈、翼顎動脈建立大鼠單純血流動力學(xué)誘導(dǎo)的顱內(nèi)動脈瘤模型,以Clotrimazol作為KCa3.1特異性阻滯劑建立CLT抑制組。通過動脈灌注Batson's#17,以血管腐蝕鑄型技術(shù)得到建模3月后動脈瘤組(n=12)、CLT抑制組(n=12)、空白對照組(n=12)以及正常對照組(n=6)大鼠腦動脈灌注樹脂模型,以掃描電鏡對大鼠動脈瘤模型的動脈鑄型進(jìn)行動脈瘤瘤樣改變評估,并將動脈瘤瘤樣改變分為四級：0級：正常血管鑄型；1級：血管管徑均勻擴(kuò)張、迂曲和/或出現(xiàn)粗糙或不規(guī)則內(nèi)皮印記；2級：淺梭形抬高；3級：囊狀動脈瘤鑄型或局部動脈瘤樣擴(kuò)張；通過測量前交通復(fù)合體體積(v=m/p)評估前交通復(fù)合體擴(kuò)張程度,并以此評估阻斷KCa3.1對動脈瘤發(fā)生的抑制作用。獲取動脈瘤組1d(n=5),1M (n=5),3M (n=5)以及上述時間點(diǎn)CLT抑制組、正常對照組(各組n=5)大鼠的Willis環(huán)新鮮血管,以RNALater保護(hù)RNA防止降解,并用rt-PCR法測定KCa3.1 mRNA的表達(dá)情況。將動脈瘤組、CLT抑制組、正常對照組在建模后1M,3M(每組各6只)后處死,以多聚甲醛灌注固定后的含有Willis環(huán)血管的大鼠腦組織取出,石蠟包埋并切片,以Alexa 488標(biāo)記的二抗染色,使用免疫熒光法激光共聚焦顯微鏡評估動脈瘤模型中KCa3.1通道蛋白的表達(dá)情況；按免疫熒光組進(jìn)行相同分組,使用免疫組化法驗(yàn)證KCa3.1下游通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)NF-κB和iNOS的表達(dá)情況。全部數(shù)據(jù)使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,Nemenyi法進(jìn)行兩兩比較或者單因素方差分析,Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較：當(dāng)p0.05時,認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果：依靠單純結(jié)扎腦供血動脈造成顱內(nèi)腦血管血流動力學(xué)改變所建立的大鼠顱內(nèi)動脈瘤模型是可行的,是研究顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生機(jī)制最為合適的動物模型。電鏡掃描結(jié)果可見：CLT抑制組大鼠ACA-OA及Acorn Complex動脈瘤瘤樣改變程度明顯較輕,大部分為均為1級改變,未觀察到2-3級改變。而動脈瘤組及空白對照組較CLT抑制組均可見顯著的瘤樣改變(p0.05),淺梭形抬高可在大多數(shù)ACA-OA及Acom Complex發(fā)現(xiàn)；Acom Complex顯著迂曲擴(kuò)張,并伴有局部的瘤樣擴(kuò)張(3級,動脈瘤組16.7%,空白對照組25%),CLT組動脈瘤樣改變與對照組無顯著差異；動脈瘤組Acom Complex的較CLT抑制組和正常對照組顯著擴(kuò)張(p0.05),CLT抑制組Acom Complex擴(kuò)張程度與正常對照組無顯著差異,由此證明特異性阻斷KCa3.1可以顯著降低在血流動力學(xué)改變的情況下顱內(nèi)動脈瘤樣改變的發(fā)生率。血流動力學(xué)改變導(dǎo)致的線性剪切應(yīng)力增加可以上調(diào)Willis環(huán)血管KCa3.1 mRNA和通道蛋白表達(dá)上調(diào),RT-PCR結(jié)果顯示各時間點(diǎn)CLT組KCa3.1 mRNA表達(dá)均顯著低于同時期動脈瘤組(1D組p0.001：1M組p0.001；3M組p0.001);動脈瘤各組KCa3.1 mRNA表達(dá)顯著高于對照組(p0.001)。通過Alexa Fluor 488標(biāo)記的二抗,共聚焦顯微鏡觀察下KCa3.1呈綠色熒光表達(dá)。對照組前交通復(fù)合體血管KCa3.1表達(dá)較弱,呈基礎(chǔ)水平；隨建模時間(即血流動力學(xué)改變時間)延長,KCa3.1的表達(dá)呈逐步增加趨勢。1M動脈瘤組KCa3.1在內(nèi)皮細(xì)胞中呈點(diǎn)片狀分布,CLT組較動脈瘤組KCa3.1表達(dá)明顯受抑制,僅在平滑肌層呈點(diǎn)樣分布；3M動脈瘤組KCa3.1轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮下層,集中連續(xù)線樣表達(dá),CLT組則在管壁全層呈點(diǎn)狀零星表達(dá),但較1M-CLT組表達(dá)略增加。以上,KCa3.1的表達(dá)上調(diào)不僅表現(xiàn)在時間層面上,也表現(xiàn)在空間層面上,逐漸由內(nèi)皮高表達(dá)轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮下層高表達(dá)。免疫組化結(jié)果表明,特異性阻斷KCa3.1的同時,也相應(yīng)的抑制了管壁NF-kB和iNOS的表達(dá),CLT抑制組各時間點(diǎn)NF-κB和iNOS的表達(dá)均較動脈瘤組弱,提示了由二者激活所帶來的管壁炎癥及氧化應(yīng)激水平的下降。結(jié)論：KCa3.1可能是將血流動力學(xué)應(yīng)力轉(zhuǎn)化為生物學(xué)信號的重要靶點(diǎn),阻斷KCa3.1可顯著抑制由血流動力學(xué)誘導(dǎo)的產(chǎn)生的管壁炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及瘤樣改變。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743.3

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本文編號：2434787