【摘要】：腦卒中是指發(fā)生于腦部血管、因血液循環(huán)障礙而造成腦組織損害的一組疾病,一般分為出血性腦卒中和缺血性腦卒中(腦梗死),而后者約占腦血管疾病的80%。在世界范圍內,由腦動脈閉塞導致的急性缺血性腦損傷是老齡人群腦卒中發(fā)病率高、死亡率高的主要原因。急性腦缺血發(fā)生后,氧化應激、炎癥因子釋放、興奮性氨基酸釋放、細胞內鈣超載、線粒體功能障礙等一系列級聯(lián)事件的發(fā)生將會導致神經(jīng)元的大量死亡。深入研究并探索有效的神經(jīng)保護藥物一直是神經(jīng)科學領域工作的重點和難點。馬來酸桂哌齊特(cinepazide maleate,CM)作為哌嗪類鈣離子通道阻滯劑,既往研究已表明其具有擴張血管和促進細胞代謝的雙重作用,而且在最近的臨床研究中還發(fā)現(xiàn)其具有與米屈肼相似的腦保護作用,然而其上述作用的相關機制卻不甚清楚。因此,本課題以線栓法大鼠大腦中動脈阻斷(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型為研究平臺,深入研究馬來酸桂哌齊特的腦保護作用及其可能的作用機制。第一部分CM對實驗性腦缺血治療效果的研究目的:研究CM對MCAO損傷Sprague-Dawley(SD)大鼠是否具有腦保護作用。方法:(1)CM最佳治療劑量探索:選擇健康雄性成年SD大鼠,通過線栓法建立mcao模型。按照術后2h神經(jīng)功能評分(neurologicalbehaviorscores,nbs)差值≤3、體重(bodyweight,bw)差值≤20g、mri軸位掃描最大梗死面積百分比≤10%的標準進行配對,共分三個cm處理組(10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg)和一個生理鹽水(normalsaline,ns)對照組,每組15只sd大鼠,分別給予腹腔注射相應劑量cm和ns。觀察各組在mcao損傷7d后的sd大鼠nbs變化情況。(2)cm對實驗性腦缺血治療效果的驗證:按(1)所述方法進行建模、配對,分為一個cm處理組(選用cm的最佳使用濃度)和一個ns對照組,每組15只符合條件的mcao模型大鼠,觀察各組在mcao損傷后1d、3d、7d的sd大鼠死亡率、bw、nbs和7d的腦梗死體積,驗證cm對mcao損傷大鼠的腦保護作用。結果:(1)10mg/kg、20mg/kg、30mg/kg三個cm處理組術后7d(pod7)的神經(jīng)行為功能恢復情況(nbs7d-nbs12h)均好于ns對照組,但只有20mg/kg組(2.05±0.19)與ns對照組(1.25±0.35)之間差異明顯(p0.05);(2)cm雖不能降低總體死亡率,卻能明顯降pod1的死亡率(cm處理組:33.33%,ns對照組:85.71%;p0.05),促進術后神經(jīng)行為功能的恢復(nbs7d-nbs12h)(cm處理組:2.00±0.24,ns對照組:1.19±0.31;p0.05),降低pod7的腦梗死體積百分比(cm處理組:24.72±4.36%,ns對照組:32.04±4.01%;p0.05),同時具有促進bw恢復的趨勢(cm處理組:252.06±8.51g;ns對照組:245.09±8.77g)。結論:cm對mcao損傷sd大鼠具有腦保護作用,且劑量為20mg/kg時效果最明顯。第二部分cm對缺血性腦損傷后細胞死亡類型的影響研究目的:驗證mcao模型缺血腦組織中細胞焦亡的存在,研究cm腦神經(jīng)保護作用與細胞不同死亡類型之間的關系。方法:mcao損傷后隨機分為cm處理組(20mg/kg)和ns對照組,通過tunel染色法觀察mcao后1、3、7d細胞凋亡的變化情況,通過tunel和il-1β免疫熒光雙標法尋找焦亡細胞,并觀察焦亡細胞數(shù)量的變化情況;通過westernblot檢測caspase-1、caspase-3、il-1β等蛋白因子的變化情況,進一步探索cm對細胞凋亡和焦亡的影響。結果:(1)在cm處理組和ns對照組1、3、7d的腦組織切片中均發(fā)現(xiàn)tunel和il-1β免疫熒光雙標的陽性細胞,驗證了mcao模型缺血腦組織中細胞焦亡的存在;(2)與ns對照組相比,cm能明顯降低1、3、7d各時間點腦組織切片中il-1β、tunel單標及兩者雙標的陽性細胞數(shù),提示cm能減輕凋亡、焦亡及il-1β炎癥因子的表達;(3)與ns對照組相比,cm能明顯抑制caspase-1、caspase-3、il-1β蛋白水平的升高,進一步印證了cm對缺血再灌注損傷導致的細胞凋亡和焦亡的抑制作用。結論:(1)驗證了缺血腦組織內焦亡細胞的存在;(2)cm可通過抑制細胞凋亡和焦亡發(fā)揮腦保護作用。第三部分cm改善缺血性腦損傷氧化還原狀態(tài)失衡作用的研究目的:研究cm是否通過抗氧化作用保護mcao損傷的腦組織。方法:mcao建模成功后隨機分為cm處理組(20mg/kg)和ns對照組,7d后取梗死區(qū)腦組織,提取組織勻漿液,分別檢測活性氧簇(ros)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)、丙二醛(malondialdehyde,mda)、還原型谷胱甘肽(glutathione,gsh)、乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,ldh)等因子的濃度變化。為盡可能減少標本差異帶來的實驗誤差,對每只sd大鼠的健側及患側均進行檢測,結果分析時采用“患側值-健側值”的差值統(tǒng)一表示。結果:(1)與ns對照組相比,cm能顯著提升細胞總抗氧化能力:明顯提高sod水平(cm處理組:5.83±7.38u/mgpro,ns對照組:-3.41±6.15u/mgpro,p0.05),降低ros水平(cm處理組:26.90±36.49u/mgpro,ns對照組:65.68±33.87u/mgpro,p0.05);(2)與ns對照組相比,cm能保護谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase,GPX)的酶活性,減輕細胞膜氧化應激損傷:明顯降低谷胱甘肽過氧化物酶(GPX酶)底物—GSH的水平(CM處理組:-1.45±1.14μmol/mgpro;NS對照組:0.29±1.81μmol/mgpro,P0.05),降低MDA水平(CM處理組:-0.13±0.19μmol/mgpro;NS對照組:0.24±0.46μmol/mgpro,P0.05);(3)與NS對照組相比,CM能減輕受損腦細胞的破裂:CM處理后,梗死區(qū)腦組織勻漿液中的LDH水平明顯升高(CM處理組:2.43±9.18U/gprot,NS對照組:-10.70±14.98U/gprot,P0.05)。結論:CM能明顯提高細胞抗氧化能力,可通過改善腦缺血損傷后氧化還原狀態(tài)失衡保護神經(jīng)細胞。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R743
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本文編號：2419712