【摘要】：腦膠質(zhì)瘤是人類最常見的難治性原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤,其中成年人最常見、惡性程度最高的多形性膠質(zhì)母細胞瘤占總原發(fā)性腦膠質(zhì)瘤的50%以上。盡管目前外科手術(shù)切除、放療、化療和生物療法等綜合治療措施有很大的進步,但預后仍較差,平均中位生存率不足一年。膠質(zhì)母細胞瘤呈現(xiàn)快速、彌漫性侵襲生長和高度異質(zhì)性,與治療抵抗密切相關(guān)。目前研究證實,膠質(zhì)瘤是一種多基因異常疾病,多種原癌基因的激活、抑癌基因的失活和多種異常的信號轉(zhuǎn)導通路是惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生進展的重要分子學機制,如表皮生長因子(EGFR)基因的擴增、PTEN缺失、P53基因的突變,Wnt/β-catenin通路、PI3K/AKT/mTOR信號通路、Notch通路等。因此,尋找導致惡性膠質(zhì)瘤發(fā)病相關(guān)的基因,深入了解膠質(zhì)瘤的分子病理,在此基礎(chǔ)上進一步開拓膠質(zhì)瘤治療的新策略和靶點,是目前膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域的熱點之一。Hippo-YAP是一個在果蠅中首先發(fā)現(xiàn)的高度保守的信號轉(zhuǎn)導通路,它通過促進細胞調(diào)亡和限制細胞增殖調(diào)控器官大小的發(fā)育。同時,該通路在哺乳動物中起抑制腫瘤生成的作用。YAP (Yes-associated protein, Yes相關(guān)蛋白)是該信號通路下游的效應因子,從果蠅到哺乳動物高度保守。當Hippo通路被抑制時,YAP能夠進入細胞核,與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子相互結(jié)合,啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。Hippo信號通路一旦被激活,上游激酶磷酸化YAP,被磷酸化的YAP能夠與細胞骨架蛋白14-3-3蛋白相互作用,停留在胞質(zhì)內(nèi),不能進入細胞核調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。YAP是腫瘤發(fā)生的一個調(diào)控因子,已經(jīng)被認為是一個原癌基因。很多腫瘤中發(fā)現(xiàn)該通路存在異常。在結(jié)腸癌、肺癌以及卵巢癌中發(fā)現(xiàn)YAP在胞質(zhì)內(nèi)和細胞核內(nèi)高表達。對YAP與膠質(zhì)瘤的研究目前檢索到國外研究者報道一篇,國內(nèi)尚未見報道。我們研究發(fā)現(xiàn)YAP在膠質(zhì)瘤細胞系以及腫瘤標本中表達均高于正常對照。為了進一步探討YAP與膠質(zhì)瘤細胞生長的關(guān)系,在本研究中采用YAPsiRNA敲低膠質(zhì)瘤細胞中YAP表達,以及對膠質(zhì)瘤細胞轉(zhuǎn)染YAP重組質(zhì)粒上調(diào)膠質(zhì)瘤細胞中的YAP表達,觀察對膠質(zhì)瘤細胞生物學行為的影響。本課題第一部分采用Real-time PCR、Western blot方法檢測了8個惡性膠質(zhì)瘤細胞系及應用免疫組織化學染色方法研究組織芯片中60例膠質(zhì)瘤標本、9例正常腦組織標本中YAP的表達水平,同時對本院臨床取留標本中的20例不同級別膠質(zhì)瘤組織標本、3例正常腦組織標本進行免疫組織化學染色檢測并分別提取RNA和蛋白質(zhì)進行相關(guān)檢測,結(jié)果表明YAP mRNA在8個膠質(zhì)瘤細胞系中顯著高表達,其中SNB19以及LN229細胞YAP表達上調(diào)最為顯著,U87以及118細胞表達上調(diào)程度最低。Western blot檢測結(jié)果與Real-time PCR結(jié)果相一致。膠質(zhì)瘤標本的Weatern blot檢測組織標本中YAP的表達水平顯著高于正常腦組織,并隨惡性程度的增高而明顯升高。Real-time PCR檢測組織標本結(jié)果結(jié)果與蛋白表達一致。膠質(zhì)瘤組織芯片進行免疫組化檢測,表達水平顯著高于正常腦組織,染色結(jié)果顯示為核陽性,YAP主要聚集于細胞核內(nèi),提示Hippo通路活性被抑制。本課題第二部分則側(cè)重于YAP表達對人腦膠質(zhì)瘤細胞生長的調(diào)控作用。應用Real-time PCR和Wetern blot方法檢測對SNB19以及LN229細胞轉(zhuǎn)染YAPsiRNA和對U87以及118細胞轉(zhuǎn)染YAP質(zhì)粒后膠質(zhì)瘤細胞中YAP表達情況,均鑒定轉(zhuǎn)染成功。然后分別進行細胞生物學行為的檢測：MTT比色法測定YAP對腫瘤細胞增殖的影響；Transwell試驗檢測膠質(zhì)瘤細胞侵襲能力的變化；流式細胞術(shù)和AnnexinV標記法分別檢測膠質(zhì)瘤細胞周期及凋亡的變化。結(jié)果表明：1、轉(zhuǎn)染YAPsiRNA可明顯敲低膠質(zhì)瘤細胞中YAP的表達,進而抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖活性,使細胞存活率下降,阻滯細胞周期于G0/G1期,侵襲能力明顯受抑制,誘導凋亡細胞。2、采用轉(zhuǎn)染YAP質(zhì)粒過表達膠質(zhì)瘤細胞中Yes相關(guān)蛋白,可以提高膠質(zhì)瘤細胞增殖活性,使細胞存活率升高；G0/G1期細胞減少,S期細胞增加；侵襲能力明顯增強；凋亡細胞減少。膠質(zhì)瘤細胞轉(zhuǎn)染YAPsiRNA后,促進增殖的相關(guān)指標Ki-67、促進侵襲的相關(guān)指標MMP-9、促進周期進展的相關(guān)指標CyclinD1以及抑制凋亡的指標BCL-2表達明顯下調(diào)。膠質(zhì)瘤細胞轉(zhuǎn)染YAP質(zhì)粒后,Ki-67、MMP-9、CyclinD1、BCL-2表達明顯上升。結(jié)論：1.YAP基因較正常腦組織在惡性膠質(zhì)瘤細胞系和膠質(zhì)瘤標本中存在高表達,與腫瘤級別呈現(xiàn)正相關(guān),提示YAP為膠質(zhì)瘤相關(guān)基因,膠質(zhì)瘤中Hippo通路活性被抑制。2.敲低膠質(zhì)瘤細胞中YAP表達可抑制腫瘤細胞增殖和侵襲,誘導細胞凋亡；,下調(diào)Ki-67、MMP-9、CyclinD1、BCL-2的表達。過表達膠質(zhì)瘤細胞系中YAP表達可提高腫瘤細胞增殖和侵襲能力,抑制細胞凋亡。Ki-67、MMP-9、CyclinD1、BCL-2表達升高。3.研究證明YAP促進膠質(zhì)瘤細胞增殖,表明YAP可成為人腦膠質(zhì)瘤基因治療的潛在候選靶點。Hippo-YAP信號通路與膠質(zhì)瘤關(guān)系密切,值得進一步深入探討。
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【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.4

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Significance and relationship between Yes-associated protein and survivin expression in gastric carcinoma and precancerous lesions[J];World Journal of Gastroenterology;2009年32期

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本文編號：2413745