【摘要】：研究背景和目的 腦出血是嚴(yán)重危害人類健康、致死致殘率較高的疾病，發(fā)病率每年11-37／10萬，占全部卒中的6％-17％，30天死亡率為38％-54％，多數(shù)幸存者殘留不同程度的神經(jīng)功能喪失。由于腦組織結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及腦出血是通過多種機制引起腦組織損害，單憑血腫清除及傳統(tǒng)治療很難達到神經(jīng)功能康復(fù)的理想效果。尋找有效的治療途徑，最大限度的減少腦出血后死亡率及改善神經(jīng)功能恢復(fù)是目前我們亟需解決的問題[1-4]。 腦出血后大量的神經(jīng)元及神經(jīng)傳導(dǎo)通路的損傷是腦出血損傷的病理機制，一旦神經(jīng)元損傷往往導(dǎo)致永久性的功能缺失.因此如何有效的控制局部炎癥反應(yīng)、減少神經(jīng)元不可逆損傷、促進神經(jīng)元再生，是目前治療出血性腦損傷亟待解決的問題。 目前,隨著營養(yǎng)因子治療在各學(xué)科的大量應(yīng)用,并且在腦出血等疾病中進行了大量基礎(chǔ)研究,促進了其向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，并且獲得了突飛猛進的進步。 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，其中最重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子為腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有促進神經(jīng)元再生和突觸聯(lián)系形成等作用[3-6]。在體外實驗中，，BDNF可以促進腦室管膜下區(qū)神經(jīng)細胞和皮質(zhì)神經(jīng)元存活[7,8]。在體內(nèi)實驗中，BDNF可以促進在腦缺血，腦創(chuàng)傷和中毒性腦損傷中的神經(jīng)元存活[9-15]。在鼠腦缺血模型中，Wolf-Rüdiger Sch bitz等，靜脈注射BDNF30分鐘后發(fā)現(xiàn)在腦皮質(zhì)區(qū)有梗死面積的減小[13]。Viorica Pencea等在側(cè)腦室注射BDNF，發(fā)現(xiàn)可以顯著增加神經(jīng)元增殖、促進神經(jīng)祖細胞及其分化后細胞的存活[16]。在鼠腦出血模型中，發(fā)現(xiàn)BDNF有減小血腫體積、組織損傷面積和促進神經(jīng)再生[17]。研究發(fā)現(xiàn)，BDNF可以使ERK1/2和Akt調(diào)節(jié)因子磷酸化，分別活化RAS/MAPK途徑和PI3K/Akt途徑來實現(xiàn)的神經(jīng)保護作用[18]，通過上調(diào)Bcl-2家族蛋白表達，下調(diào)Bax蛋白表達實現(xiàn)抗神經(jīng)元凋亡作用[13]。本課題組前期研究中驗證了膠原結(jié)合區(qū)（CBD）結(jié)合BDNF促進大鼠缺血性腦損傷的神經(jīng)再生作用，在神經(jīng)元抗凋亡和血管新生方面取得了較好療效[19]。 由于血腦屏障對腦組織的保護，傳統(tǒng)的靜脈注射不能安全有效地將藥物送到腦損傷部位發(fā)揮作用，利用病毒、脂質(zhì)體、殼聚糖等藥物載體，可以運送藥物進入顱腔，但存在安全性和靶向性差等諸多問題。靶向治療為藥物定向輸送和減小藥物副作用帶來了希望。然而，能否找到靶向治療的特異性靶點是解決問題的關(guān)鍵，在腦出血損傷區(qū)域是否有特異性靶向位點？我們能否找到一種生物材料結(jié)合此靶點安全、持續(xù)緩慢釋放藥物？這些結(jié)果不僅可以為新型材料靶向治療提供理論基礎(chǔ)而且關(guān)系到藥物靶向治療腦出血的臨床應(yīng)用前景。 CBD (collagen-bingding domain),是一種膠原結(jié)合區(qū)。它是人們研究膠原酶作用位點時發(fā)現(xiàn)的多肽結(jié)構(gòu)。應(yīng)用聚合酶連鎖反應(yīng)（PCR）技術(shù),將基因片段CBD-BDNF擴增,轉(zhuǎn)入載體pET-28a中,然后轉(zhuǎn)染E.coli,使其表達目的蛋白,用CBD修飾BDNF,形成CBD-BDNF。形成BDNF固定于膠原表面的緩釋系統(tǒng)。實驗結(jié)果顯示CBD-BDNF對神經(jīng)損傷的修復(fù)作用遠遠好于單一BDNF。 大量膠原（I型）廣泛分布于大鼠的室管膜下區(qū)(subventricularzone, SVZ)。并且內(nèi)源性神經(jīng)祖細胞產(chǎn)生、增殖的主要位置為SVZ區(qū)。因此,本課題的目的是探討靶向SVZ區(qū)膠原的BDNF治療腦出血的效果,探討CBD-BDNF治療ICH的過程中，能否具有以下優(yōu)勢。第一，在時間上，形成持續(xù)時間較長的緩釋系統(tǒng)。第二，在空間上,更加直接的刺激來源于SVZ區(qū)的內(nèi)源性神經(jīng)祖細胞的增殖,有利于修復(fù)腦出血后的損傷,加快了BDNF治療ICH從基礎(chǔ)到臨床轉(zhuǎn)化的步伐。 研究內(nèi)容和方法 擬建立大鼠ICH模型,研究膠原靶向的BDNF對ICH損傷后的作用。課題研究的主要內(nèi)容如下：制作SD大鼠ICH模型，以Ⅳ型膠原酶通過立體定向的方法注射到大鼠尾狀核的位置。隨機分組：磷酸鹽緩沖液組（PBS組），BDNF治療組。在側(cè)腦室內(nèi)分別注射10ul PBS，10ul NAT-BDNF，10ul CBD-BDNF。治療后2w,各組分別作行為學(xué)評分、小動物PET、齲齒動物SPECT、7.0T小動物MRI掃描、免疫組織化學(xué)染色,評價CBD-BDNF治療大鼠ICH的療效和作用機制。 研究結(jié)果 1.CBD-BDNF增強了腦損傷后的修復(fù)作用，主要體現(xiàn)在CBD-BDNF治療組神經(jīng)功能恢復(fù)優(yōu)于NAT-BDNF組及PBS組。CBD-BDNF治療組出血周邊區(qū)的神經(jīng)元存活數(shù)目及新生血管數(shù)量明顯多于PBS組。 2.Micro-PET結(jié)果顯示CBD-BDNF治療組出血側(cè)有代謝活性的腦組織增多。SPECT/CT灌注顯像顯示CBD-BDNF治療組腦出血損傷側(cè)的局部灌注缺失區(qū)域明顯減少。MRI顯像顯示CBD-BDNF治療組腦出血損傷后血腫的體積明顯小于NAT-BDNF和PBS組。并且通過功能磁共振fMRI評估可發(fā)現(xiàn)CBD-BDNF治療組的神經(jīng)元再生和恢復(fù)好于NAT-BDNF和PBS組。最后經(jīng)T2WI測量可得出，組織損傷的程度CBD-BDNF治療組明顯小于NAT-BDNF和PBS組。 3.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子能改善腦損傷大鼠的功能;上調(diào)新生神經(jīng)元（PCNA），神經(jīng)膠質(zhì)細胞細胞（GFAP），成熟神經(jīng)元（NeuN）等蛋白的表達，減少神經(jīng)細胞凋亡可能是其主要機制之一。 結(jié)論 1.CBD-BDNF經(jīng)SVZ區(qū)注射后可以促進SVZ區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)祖細胞的增殖、分化，保護受損神經(jīng)元,抑制凋亡，提高新生血管的數(shù)量，顯著提高ICH后SD大鼠的腦神經(jīng)功能的恢復(fù)。 2.7.0T MRI可在活體狀態(tài)下快速、準(zhǔn)確、無創(chuàng)地評價腦出血動物模型的腦損傷后組織結(jié)構(gòu)、組織水腫程度、神經(jīng)元代謝產(chǎn)物的改變，為ICH后的評估及制定治療方案提供可靠的參考。
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【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R743.34


本文編號：2403436