【摘要】：研究背景和目的 腦膠質(zhì)瘤是成人顱內(nèi)腫瘤中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。目前,即使經(jīng)手術(shù)切除及放化療等綜合治療,大部分的惡性膠質(zhì)瘤患者仍只有較短的生存期,且在6個月內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)。根據(jù)組織學(xué)的研究,因腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞本身具有向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的特點,而使得膠質(zhì)瘤瘤體內(nèi)產(chǎn)生高度血管化現(xiàn)象,這為腫瘤的發(fā)展提供了重要的營養(yǎng)支持。在以往的研究中,血管內(nèi)皮細(xì)胞組成的血管結(jié)構(gòu)被考慮為腫瘤供血的唯一方式,所以抑制腫瘤血管生成的藥物及策略,也被廣泛的應(yīng)用于對抗惡性腫瘤的治療中。但近年來,有研究者發(fā)現(xiàn),盡管抗血管生成治療能夠延緩腫瘤的發(fā)展過程,但在延長患者生存期的方面,依舊未能取得令人滿意的結(jié)果。 1999年,Maniotis發(fā)現(xiàn)惡性黑色素瘤體內(nèi)的供血管腔并非由血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成,而是由自身黑色素瘤細(xì)胞組成的一種管道,替代了原始血管的功能。研究中發(fā)現(xiàn)在該管道中存在紅細(xì)胞及血小板,證明了由這種自身瘤細(xì)胞組成的管腔樣結(jié)構(gòu)能夠為腫瘤在缺氧和缺血的情況下輸送營養(yǎng)物質(zhì)。而這種腫瘤細(xì)胞自身血管化的現(xiàn)象被稱之為“血管生成擬態(tài)”(vasculogenic mimicry,VM),自該現(xiàn)象首次被發(fā)現(xiàn)后,研究者們也陸續(xù)在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃腸道腫瘤、卵巢癌、膠質(zhì)瘤等惡性腫瘤瘤體中找到了血管生成擬態(tài)的存在,而且發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象與患者臨床治療效果的生存預(yù)后呈負(fù)向關(guān)系。因此,有研究者提出把抗血管生成治療與抗血管擬態(tài)生成治療結(jié)合在一起,可能是一種更好的抑制腫瘤供血的策略。 目前,關(guān)于血管生成擬態(tài)的機(jī)制尚未完全闡明,仍存在著許多不完善的地方,但現(xiàn)有的研究成果能給予有志于此方向的研究工作者很大的啟示,如與胚胎血管生成的分子機(jī)制相似的信號通道分子：血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏附素(Vascular endothelial cadhin,VE-cad)、上皮細(xì)胞激酶(Erythropoietin-producing hepatocellular carcinoma-A2,EphA2)、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPS)、局部黏著斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)、磷脂酞肌醇-3-激酶(Phosphoinositide3-Kinase,PI3K)、層黏連蛋白(Laminin-5y2)與腫瘤細(xì)胞去分化能力和重塑性相關(guān)的環(huán)腺甘酸(CyclicAMP,cAMP)、 Notch、 Nodal,還有血管內(nèi)皮因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor,HIF)、環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)和組織因子途徑抑制因子-2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)等。以上的信號分子都能夠直接或間接地參與血管生成擬態(tài)的發(fā)生發(fā)展過程。這些年來,關(guān)于各類惡性腫瘤中血管生成擬態(tài)形成的大量研究結(jié)果表明,腫瘤內(nèi)血管生成擬態(tài)發(fā)展過程中的經(jīng)典信號通道分子包括EphA2、 VE-cadherin、MMP-2/MMP-9、 MT1-MMP和LAMC2。已有研究證實MMP-2可能是膠質(zhì)瘤中形成血管生成擬態(tài)的關(guān)鍵信號分子�；谏鲜鲅芯�,在2011年本課題組ling通過實驗在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251血管生成擬態(tài)的研究中亦證實該觀點：通過間接地抑制MMP-2活性的表達(dá),從而減少血管生成擬態(tài)的形成。這些研究結(jié)果顯示MMP-2在血管生成擬態(tài)的形成中起著非常重要的作用。 阿托伐他汀作為HMG-CoA還原酶選擇性抑制劑,在臨床上廣泛地被應(yīng)用于降低血液中的膽固醇含量。近年來有許多研究發(fā)現(xiàn),阿托伐他汀可作為一種腦保護(hù)劑。在腦出血、缺血、炎癥、外傷等情況下,該藥通過對金屬蛋白酶-2的抑制可以降低損傷的風(fēng)險。不僅如此,亦有研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可通過抑制金屬蛋白酶-2的表達(dá),實現(xiàn)抗腫瘤作用。在本研究中,我們選擇阿托伐他汀作為干預(yù)因素,探討其能否影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞金屬蛋白酶-2的表達(dá),并進(jìn)一步觀察其對血管生成擬態(tài)生成產(chǎn)生影響。 方法 1、血管生成擬態(tài)模型的建立：按1：1比例混合基質(zhì)膠和培養(yǎng)液,平鋪于24空板中凝固成膠,取細(xì)胞密度5×104/m1lml接種于已鋪膠孔板中孵育. 2、CCK-8細(xì)胞活力測定法：U87MG細(xì)胞以2000個細(xì)胞／孔的密度分別接種于96板,分為陰性對照組、阿托伐他汀10-10mol/L組、阿托伐他汀10-9mol/L組、阿托伐他汀10+8mol/L組、阿托伐他汀10-7mol/L組、阿托伐他汀10-6mol/L組、阿托伐他汀10-5mol/L組和阿托伐他汀10-4mol/L組,并設(shè)置空白對照組及溶劑對照組,共8組,每組均設(shè)3個復(fù)孔,定量檢測梯度濃度阿托伐他汀對U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性的影響。 3、免疫印跡Western Blotting檢測阿托伐他汀干預(yù)下U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞金屬蛋白酶-2蛋白的表達(dá)。 4、QPCR檢測阿托伐他汀干預(yù)下U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞金屬蛋白酶-2基因的表達(dá)。 5、血管生成擬態(tài)計數(shù)：倒置顯微鏡下觀察不同濃度的U87細(xì)胞形成血管生成擬態(tài)的能力,通過ImageJ軟件技術(shù)測量網(wǎng)狀管道長度。結(jié)果 1、血管生成擬態(tài)模型建立結(jié)果：U87細(xì)胞接種于24空板內(nèi)6-8小時之后,伸出細(xì)長突起,彼此互相連接,形成網(wǎng)絡(luò)樣和環(huán)狀結(jié)構(gòu)。 2、CCK-8細(xì)胞活力測定結(jié)果：10-4mol/L阿托伐他汀作用于U87細(xì)胞24h后,細(xì)胞活力百分明顯降低,與空白對照組、溶劑對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；阿托伐他汀10-9-10-5mol/L各組U87細(xì)胞活力與空白對照組、溶劑對照組相比無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。根據(jù)此結(jié)果,本研究選擇藥物安全濃度范圍10-7-10-5mol/L作為后續(xù)實驗的藥物濃度。 3、免疫印跡Western Blotting結(jié)果：收集經(jīng)10mol/L、10-6mol/L.10-5mol/L阿托伐他汀孵化和未加藥組的U87細(xì)胞,檢測各組細(xì)胞中MMP-2的蛋白表達(dá),10-5mol/L阿托伐他汀孵化U87細(xì)胞24小時,金屬蛋白酶-2的表達(dá)最低。10-6mol/L、10-7mol/L阿托伐他汀干預(yù)U87細(xì)胞24小時,U87細(xì)胞MMP-2表達(dá)隨濃度遞減而增高。未加藥組的MMP-2表達(dá)最高。 4、熒光定量PCR檢測結(jié)果：收集經(jīng)10-7mol/L、10-6mo1/L、10-5mol/L阿托伐他汀孵化和未加藥組的U87細(xì)胞,檢測各組細(xì)胞中MMP-2的基因表達(dá)。單因素方差分析結(jié)果表示,10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L阿托伐他汀藥物干預(yù)組與未加藥組比較,MMP-2mRNA的表達(dá)均較少,并隨濃度遞增而逐漸減少,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 5、U87細(xì)胞血管生成擬態(tài)觀察及管腔樣結(jié)構(gòu)長度計數(shù)結(jié)果：10-7-10-5mol/L加藥干預(yù)組和未加藥組細(xì)胞培養(yǎng)液培育U87細(xì)胞24小時后,接種在24孔板上已凝固的基質(zhì)膠上,6-8小時后在100倍鏡下觀察網(wǎng)狀管道結(jié)構(gòu)的形成,未加藥組的U87細(xì)胞可形成典型的網(wǎng)狀管道血管生成擬態(tài),并隨阿托伐他汀藥物濃度的遞增,細(xì)胞間形成的網(wǎng)狀管道結(jié)構(gòu)越來越少。統(tǒng)計學(xué)分析表明：4組的血管生成擬態(tài)管腔樣結(jié)構(gòu)長度計數(shù)比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；進(jìn)一步多重比較結(jié)果顯示：10-7、10-6、10-5mol/L阿托伐他汀干預(yù)組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 隨著阿托伐他汀藥物濃度的提高,MMP-2的基因和蛋白表達(dá)均逐漸降低,且相應(yīng)伴隨著血管生成擬態(tài)形成的能力逐漸減弱,提示阿托伐他汀可能通過對U87細(xì)胞MMP-2表達(dá)的抑制,從而影響到U87細(xì)胞血管生成擬態(tài)的進(jìn)一步發(fā)展。這一研究希望做為一種抗腫瘤的新的輔助治療。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2402742