【摘要】：研究認(rèn)為,膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多基因異常改變及其相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常。不同的通路之間形成嚴(yán)密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),共同調(diào)節(jié)著腫瘤細(xì)胞的一系列生理過程及多種機(jī)制異常的病理過程。文獻(xiàn)報(bào)道上百種miRNAs與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。其中miR-451位于染色體17q11.2,多種惡性腫瘤,如膠質(zhì)瘤、乳腺癌、卵巢癌等均發(fā)現(xiàn)有miR-451的異常表達(dá)。前期研究發(fā)現(xiàn)手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤標(biāo)本中,miR-451低表達(dá),且病理級(jí)別越高,其表達(dá)越低。隨后通過Lipofectamine2000為載體,應(yīng)用miR-451mimics使膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中miR-451上調(diào),并通過細(xì)胞周期檢測(cè)、MTT、侵襲實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)等手段,驗(yàn)證了miR-451的抑癌基因作用。并且進(jìn)一步研究確定,CAB39為miR-451的靶基因,可通過LKB1(CAB39)-AMPK-PI3K-AKT通路來發(fā)揮抑癌基因的作用。但由于PI3K-AKT通路只是惡性腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的一部分,也是多種信號(hào)通路的共有部分,miR-451是否可通過AMPK調(diào)控其它通路及其具體機(jī)制尚未完全明確。惡性腫瘤快速增殖,會(huì)產(chǎn)生不同程度的缺氧,進(jìn)而引起AMPK及HIF-1α的激活及表達(dá),最終引起血管生成刺激因子VEGF表達(dá)升高,促進(jìn)腫瘤新生血管生成、增殖及轉(zhuǎn)移。多種惡性腫瘤均存在AMPK-HIF-1α通路的異常激活。文獻(xiàn)報(bào)道:miR-23b作為癌基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高表達(dá),下調(diào)miR-23b的表達(dá)可導(dǎo)致HIF-1a/VEGF通路受到抑制,而miR-451與miR-23b的作用正好相反,因此在膠質(zhì)瘤中,是否可以通過miR-451上調(diào),從而抑制AMPK-HIF-1α-VEGF通路,最終達(dá)到抑制腫瘤增殖、新生血管生成,降低腫瘤的侵襲性和復(fù)發(fā),是此項(xiàng)研究關(guān)注并要解決的問題。隨著分子生物學(xué)進(jìn)展,基因治療在惡性膠質(zhì)瘤的綜合治療中前景光明。而選取合適、高效的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體是要優(yōu)先考慮的問題。以細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療載體逐漸引起重視并成為有前景的抗腫瘤藥物/基因傳遞系統(tǒng)。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)來源豐富、易于體外分離和培養(yǎng)、能向腫瘤趨向移動(dòng),可將治療用的藥物/基因運(yùn)送至腫瘤內(nèi)部,逐漸成為有應(yīng)用前景的細(xì)胞治療載體。本課題擬應(yīng)用人骨髓干細(xì)胞作為細(xì)胞載體攜帶miR-451,轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞,從而觀察mir-451以cab39為靶標(biāo),通過ampk-hif-1α-vegf通路對(duì)膠質(zhì)瘤的調(diào)控作用。研究共分為三部分。第一部分是人骨髓干細(xì)胞(hbmscs)的分離、培養(yǎng)、鑒定及其作為基因治療載體的文獻(xiàn)回顧研究。骨髓組織取自成年男性股骨干骨折手術(shù)患者,采用密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法進(jìn)行hbmscs的分離。hbmscs獲得后,常規(guī)傳代培養(yǎng)3~5代可將各種非貼壁細(xì)胞和混雜細(xì)胞除去,從而建立高度純化、性狀穩(wěn)定的hbmscs細(xì)胞系。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)cd29、cd44、cd71抗原陽性,hla-dr、cd34、cd45抗原陰性。隨后進(jìn)行體外分化能力誘導(dǎo)培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可向成脂及成骨分化,證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為hbmscs,符合實(shí)驗(yàn)要求。隨后通過文獻(xiàn)分析和總結(jié),表明hbmscs有良好的趨向腫瘤移動(dòng)潛能,及可以作為細(xì)胞載體攜帶治療所用基因及改造的細(xì)胞因子用于惡性膠質(zhì)瘤的基因治療。第二部分在體外研究中,我們先以慢病毒為載體將mir-451轉(zhuǎn)染至hbmscs,并用rt-pcr的方法檢測(cè)被轉(zhuǎn)染的hbmscs中mir-451表達(dá)情況。隨后取感染hbmscs的上清液,與u87、u251、ln229人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系混合培養(yǎng),上調(diào)腫瘤細(xì)胞中的mir-451的表達(dá),并用rt-pcr的方法驗(yàn)證。我們將實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)組:control組,hbmscs組及l(fā)v-mir-451-hbmscs組。分別應(yīng)用mtt法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期分析、transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)、anexinv及westernblot等方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡等能力,進(jìn)一步驗(yàn)證mir-451作為膠質(zhì)瘤的抑癌基因。這些結(jié)果顯示出hbmscs良好的載體功能,以及mir-451以cab39為靶標(biāo),對(duì)ampk-hif1α-vegf通路的調(diào)控作用。第三部分主要是通過制備裸鼠異源原位膠質(zhì)瘤顱內(nèi)模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。我們通過立體定向注射的方式,建立顱內(nèi)膠質(zhì)瘤模型。7天后,將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)化分為3組,施加不同的處理措施,主要分為:lv-mir-451-hbmscs組,hbmscs組及control組,行活體成像,并給予治療措施。觀察三組裸鼠治療期間體重變化、活體成像熒光強(qiáng)度,記錄每只小鼠死亡的時(shí)間,描繪生存曲線,并用kaplan-meier法進(jìn)行生存分析。將死亡裸鼠腦組織行h-e及免疫組化染色。結(jié)果顯示,治療組裸鼠體內(nèi)熒光強(qiáng)度顯著弱于后兩組,且生存期顯著長(zhǎng)于其它兩組。免疫組化提示治療組中ampk-hif-1α-vegf通路中的成員lkb1、ampk、hif-1α及vegf在lv-mir-451-hbmscs組中均表達(dá)下降。上述結(jié)果充分驗(yàn)證了膠質(zhì)瘤中mir-451通過ampk-hif-1α-vegf通路調(diào)控抑制膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：2401473