【摘要】：背景和目的:蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是指腦表面血管破裂血液進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔的一種常見的出血性腦卒中,發(fā)病率占出血性卒中的10%。有30%SAH病人在入院之前已經(jīng)死亡,而未死亡的患者致殘率有50%,而且通常伴有認(rèn)知障礙、心理障礙、記憶障礙、日常自主行為能力下降和生活質(zhì)量降低。對SAH繼發(fā)腦損傷已有數(shù)十年研究,但其機(jī)制仍未完全闡明,以往的研究主要集中在腦血管痙攣的保護(hù)上,但是近期一項多中心、隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照的臨床試驗(yàn)表明,選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑Clazosentan能夠改善血管痙攣,但并不能減少SAH死亡率以及神經(jīng)功能損傷,促使研究方向發(fā)生轉(zhuǎn)變。有證據(jù)表明提出在SAH發(fā)生同時神經(jīng)功能損傷已經(jīng)開始,SAH數(shù)分鐘內(nèi)神經(jīng)元凋亡,壞死,過度興奮已經(jīng)有發(fā)生,John H. Zhang提出將SAH72小時內(nèi)的損傷定義為“早期腦損傷”,對早期腦損傷的干預(yù)是減少SAH死亡率提高神經(jīng)功能的重要手段。然而,由于近年來單純神經(jīng)保護(hù)劑的臨床試驗(yàn)均宣告失敗,促使我們思考保護(hù)神經(jīng)元之外的其他細(xì)胞的損傷,包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞(pericyte )、小膠質(zhì)細(xì)胞,這些細(xì)胞作為一個整體共同構(gòu)成了神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)(neurovascular network)。其中由內(nèi)皮細(xì)胞及其之間的緊密連接、周細(xì)胞、基膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞組成的血腦屏障(blood brain barrier, BBB)是神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)的一個重要的單元,臨床及動物實(shí)驗(yàn)均表明血腦屏障受損會導(dǎo)致神經(jīng)功能的缺損,修復(fù)血腦屏障能促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù),而且周細(xì)胞在其中起重要調(diào)控作用,所以血腦屏障損傷是SAH后早期腦損傷的重要靶點(diǎn)。本研究基于前期工作基礎(chǔ),通過干預(yù)血管神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中周細(xì)胞以及血腦屏障,觀察血腦屏障在SAH中的作用,為轉(zhuǎn)化研究提供實(shí)驗(yàn)證據(jù),為臨床治療提供新的思路。材料與方法:1.采用頸內(nèi)動脈血管穿刺法建立小鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血模型2.在蛛網(wǎng)膜下腔出血前48小時側(cè)腦室注射CD147SiRNA,在蛛網(wǎng)膜下腔出血后3小時注射CypA重組蛋白,評價SAH出血量,神經(jīng)功能損傷,腦水含量,依文思藍(lán)通透性,活體熒光依文思藍(lán)熒光強(qiáng)度,免疫熒光及Western Blot,進(jìn)一步評價周細(xì)胞CypA及其受體CD147在SAH后的表達(dá)變化以及調(diào)控血腦屏障的機(jī)制。在離體培養(yǎng)周細(xì)胞中加入氧合血紅蛋白,構(gòu)建離體SAH后周細(xì)胞損傷模型,加入CypA重組蛋白,及CD147 SiRNA,用ELISA及Western評價胞內(nèi)及分泌CypA和CD147隨時間的表達(dá)變化,用ELISA評價加入氧合血紅蛋白后MMP9隨時間的表達(dá)變化以及加入CypA和CD147 SiRNA后的表達(dá)變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測CypA不同內(nèi)吞抑制劑對周細(xì)胞攝取CypA的作用。使用ELISA檢測內(nèi)吞抑制劑對周細(xì)胞分泌MMP9的影響。3.在蛛網(wǎng)膜下腔出血后使用三種劑量環(huán)孢素干預(yù),觀察神經(jīng)功能和腦水含量改變選出最優(yōu)劑量。使用最優(yōu)劑量干預(yù),觀察蛛網(wǎng)膜西腔出血后四型膠原完整性、依文思藍(lán)滲出、NF-κB入核以及MMP9的分泌,進(jìn)一步評價環(huán)孢素保護(hù)血腦屏障的機(jī)制。4.使用周細(xì)胞敲除小鼠制作SAH模型,觀察SAH出血量,神經(jīng)功能損傷,依文思藍(lán)滲出,進(jìn)一步評價周細(xì)胞在血腦屏障損傷中的機(jī)制。結(jié)果:1.在SAH后,腦周細(xì)胞CypA和CD147表達(dá)顯著升高,CypA在24小時達(dá)到高峰并持續(xù)到72小時,CD147在24小時達(dá)到高峰并在72小時開始下降。CypA重組蛋白能夠加重神經(jīng)功能損傷,腦水含量以及依文思藍(lán)滲出,這些改變與NF-κB的入核,MMP9 表達(dá)升高,collagen Ⅳ,ZO-1,Occludin,Claudin5 蛋白表達(dá)下調(diào)。CD147 SiRNA能夠逆轉(zhuǎn)CypA的損傷作用,表現(xiàn)出抑制NF-κB的入核及MMP9的表達(dá),上調(diào)collagenⅣ,ZO-1,Occludin, Claudin5蛋白表達(dá)。綜上我們認(rèn)為CypA促進(jìn)了 SAH后血腦屏障的損傷。2.在氧合血紅蛋白處理離體培養(yǎng)的周細(xì)胞,周細(xì)胞內(nèi)CypA和CD147表達(dá)顯著升高,CypA在24小時達(dá)到高峰并在72小時開始下降,CD147在24小時達(dá)到高峰并持續(xù)到72小時,周細(xì)胞分泌的CypA在24小時達(dá)到高峰在72小時開始下降。重組CypA促進(jìn)周細(xì)胞分泌MMP9, CD147 SiRNA與重組CypA同時作用,抑制了 MMP9的分泌。氯丙嗪可以抑制周細(xì)胞內(nèi)吞CypA但是不能減少M(fèi)MP9的分泌,CD147 siRNA不能抑制周細(xì)胞內(nèi)吞CypA。通過以上實(shí)驗(yàn),我們得出CypA是通過直接作用于周細(xì)胞CD147促進(jìn)MMP9的分泌,而不是通過內(nèi)吞CypA來產(chǎn)生作用。3. CypA敲除的小鼠,在SAH后死亡率及出血量與野生型沒有差異,但神經(jīng)功能評分優(yōu)于野生型,依文思藍(lán)滲出減少,進(jìn)一步說明CypA是SAH后血腦屏障損傷和神經(jīng)功能損傷的重要調(diào)控因素。4. SAH后,通過三種劑量的環(huán)孢素處理,15mg/kg的環(huán)孢素能在24小時減少神經(jīng)功能損傷,腦水含量,以及依文思藍(lán)滲出,1Omg/kg能在72小時減少腦水含量,神經(jīng)功能損傷,5mg/kg在72小時仍不能減少神經(jīng)能損傷,腦水含量,以及依文思藍(lán)滲出。SAH后,腦組織NF-κB的入核及MMP9的表達(dá)增加,collagen Ⅳ,ZO-1,Occludin,Claudin5蛋白表達(dá)減少。使用15mg/kg環(huán)孢素能逆轉(zhuǎn)NF-κB的入核及MMP9的表達(dá),上調(diào)collagen Ⅳ,ZO-1,Occludin, Claudin5蛋白表達(dá)。通過上述研究我們得出環(huán)孢素15mg/kg是一個優(yōu)化劑量,環(huán)孢素是通過逆轉(zhuǎn)NF-κB的入核及MMP9的表達(dá),上調(diào)collagen Ⅳ,ZO-1, Occludin,Claudin5蛋白表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對血腦屏障的保護(hù)。5.成年周細(xì)胞敲除小鼠的蛛網(wǎng)膜下腔出血后72h死亡率明顯高于野生型,且肺泡塌陷更嚴(yán)重,P/F值降低,肺部SPB、SPC表達(dá)降低,周細(xì)胞敲除小鼠在蛛網(wǎng)膜下腔出血后的急性肺損傷與PDGFB信號以及SPB和SPC表達(dá)將減少有關(guān)。結(jié)論:1.SAH后周細(xì)胞CypA及CD147表達(dá)上調(diào),外源性CypA能加重血腦屏障損傷及是神經(jīng)功能預(yù)后不良,其機(jī)制可能與周細(xì)胞CD147受體介導(dǎo)的NF-κB的入核及MMP9的表達(dá)損傷基膜以及細(xì)胞之間的緊密連接蛋白有關(guān),CD147 SiRNA可能成為改善SAH血腦屏障損傷提高預(yù)后的新選擇。2. 15mg/kg環(huán)孢素能減少SAH后血腦屏障損傷,可能是通過減少NF-κB的入核及MMP9分泌來實(shí)現(xiàn)的,環(huán)孢素作為臨床常用藥物,可能轉(zhuǎn)化成為早期腦損傷的可靠治療藥物。3.血管神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)尤其是周細(xì)胞在對腦組織微循環(huán)穩(wěn)態(tài),損傷后修復(fù)的過程中起到重要作用,針對周細(xì)胞以及血管神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的的治療,可能從早期腦損傷的病理生理過程來減少損傷,改善患者的預(yù)后,基于血管神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)周細(xì)胞的研究可能為SAH的臨床轉(zhuǎn)化及治療提供有效的方法。4.蛛網(wǎng)膜下腔出血后肺損傷對死亡率有重要影響,PDGFB信號以及肺泡表面活性物質(zhì)SPB、SPC減少在其中起重要作用,通過減少肺損傷可以減少蛛網(wǎng)膜下腔出血后死亡率使患者受益。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R743.35

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本文編號：2385272