發(fā)布時間：2018-12-10 23:06

【摘要】：第一部分 rBMSCs分泌IL-6改善HIBD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能目的明確大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSCs)來源的IL-6在移植治療缺氧缺血性腦損傷(HIBD)大鼠中的作用。方法將7日齡SD大鼠通過Rice法結(jié)扎左側(cè)頸總動脈,建立HIBD模型,5d后將腦損傷大鼠隨機分為HIBD組、HIBD+MSCs組、HIBD+GFP MSCs組和HIBD+si IL-6 MSCs組,后三組大鼠每只經(jīng)側(cè)腦室注射5μl含2×105個不同處理rBMSCs的細(xì)胞懸液,HIBD組注射等體積滅菌PBS。ELISA檢測rBMSCs培養(yǎng)上清中IL-6、IL-10、TNFα、IFNβ、IL-8和IL-1β分泌水平。rBMSCs移植2d和9d后取大鼠左側(cè)腦組織通過ELISA檢測IL-6水平;移植9d后取大鼠腦組織進(jìn)行TUNEL染色,檢測左側(cè)腦組織細(xì)胞凋亡情況;移植3w后行Object-in-place檢測各組大鼠對新事物的探索能力,4w后行Morris水迷宮檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶功能,6w后通過LTP檢測大鼠海馬突觸可塑性。結(jié)果(1)Morris水迷宮檢測顯示,rBMSCs移植組大鼠在訓(xùn)練過程中找到平臺所用時間較HIBD組短,撤去平臺后穿越平臺區(qū)域次數(shù)較HIBD組顯著增加(P0.05);而si IL-6 MSCs移植組大鼠在訓(xùn)練過程中找到平臺所用時間卻較HIBD+GFP MSCs組長,撤去平臺后穿越平臺區(qū)域次數(shù)較HIBD+GFP MSCs組明顯減少(P0.05)。(2)Object-in-place檢測結(jié)果顯示,rBMSCs移植組大鼠對新事物的探索能力明顯強于HIBD組(P0.05),但si IL-6 MSCs移植組大鼠對新事物的探索能力卻顯著弱于HIBD+GFP MSCs組(P0.05)。(3)LTP檢測顯示,rBMSCs移植組大鼠海馬腦片在高頻電刺激后f EPSP(134.2%±4.3%)增加明顯多于HIBD組(117.1%±4.6%),而si IL-6 MSCs移植組大鼠海馬腦片的f EPSP(131.2%±4.8%)增加幅度明顯弱于HIBD+GFP MSCs組(160%±4.5%)。(4)ELISA檢測結(jié)果顯示,rBMSCs分泌的IL-6水平明顯高于其他細(xì)胞因子(IL-10、TNFα、IFNβ、IL-8和IL-1β)。(5)TUNEL染色分析結(jié)果表明,rBMSCs移植組大鼠左側(cè)大腦皮層中凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于HIBD組(P0.05),但si IL-6 MSCs移植組大鼠左側(cè)大腦皮層中凋亡細(xì)胞數(shù)卻明顯多于HIBD+GFP MSCs組(P0.05)。(6)ELISA檢測損傷大鼠左側(cè)腦組織中IL-6水平,發(fā)現(xiàn)rBMSCs移植組IL-6水平在移植后2d和9d均顯著高于HIBD組(P0.05),而si IL-6 MSCs移植組大鼠左側(cè)腦組織中IL-6水平卻明顯低于HIBD+GFP MSCs組(P0.05)。結(jié)論(1)rBMSCs內(nèi)源性高表達(dá)IL-6。(2)rBMSCs移植可改善HIBD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和對新事物的探索能力,增強海馬突觸可塑性;然而沉默rBMSCs中IL-6可減弱rBMSCs對HIBD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和對新事物探索能力的改善作用,降低海馬突觸可塑性。(3)rBMSCs移植可增加HIBD大鼠腦組織中IL-6分泌水平,抑制HIBD大鼠腦細(xì)胞凋亡;抑制rBMSCs中IL-6分泌水平后,HIBD大鼠腦組織中IL-6分泌水平顯著降低,rBMSCs抑制HIBD大鼠腦細(xì)胞凋亡作用明顯減弱。第二部分 rBMSCs來源IL-6激活神經(jīng)元STAT3信號通路抑制HIBD所致炎癥因子分泌目的探討rBMSCs來源IL-6在移植治療HIBD過程中對神經(jīng)元保護(hù)作用的可能機制。方法體外原代培養(yǎng)胎鼠海馬神經(jīng)元,于培養(yǎng)第5d經(jīng)NSE鑒定其純度。將培養(yǎng)第5d的原代神經(jīng)元行OGD損傷,隨后再分別與rBMSCs、si IL-6 MSCs及GFP MSCs分離共培養(yǎng),同時以O(shè)GD損傷或未損傷為對照組。第6d提取神經(jīng)元總RNA,real-time PCR分別檢測IL-6R、STAT3、Bax、Bcl-2和SOCS1的m RNA表達(dá)水平;Annexin V-FITC/PI雙染檢測神經(jīng)元凋亡情況。第7d收集培養(yǎng)上清,ELISA檢測上清中IL-6分泌水平;western blot檢測IL-6R、STAT3、Bax和Bcl-2的蛋白表達(dá)水平。同時分別在rBMSCs移植后2d和9d,提取HIBD、HIBD+MSCs、HIBD+si IL-6 MSCs和HIBD+GFP MSCs四個實驗組的大鼠腦組織,ELISA檢測左側(cè)腦組織中IFNγ和IP-10的表達(dá)水平;并利用免疫熒光雙標(biāo)染色檢測rBMSCs移植后9d HIBD+si IL-6 MSCs組及HIBD+GFP MSCs組大鼠左側(cè)腦組織中NSE/Bcl-2共定位表達(dá)情況。結(jié)果(1)經(jīng)NSE免疫熒光觀察,發(fā)現(xiàn)原代胎鼠海馬神經(jīng)元NSE陽性率90%,純度滿足實驗要求。(2)rBMSCs與OGD損傷后的神經(jīng)元分離共培養(yǎng)后,神經(jīng)元培養(yǎng)上清中IL-6水平顯著增高(P0.05),IL-6R、STAT3 m RNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P0.05);但control、OGD和OGD+MSCs三組神經(jīng)元中Bax、Bcl-2 m RNA和蛋白表達(dá)水平無顯著差異,Annexin V-FITC/PI雙染也顯示上述三組神經(jīng)元凋亡情況無明顯差異。(3)si IL-6 MSCs與OGD損傷后的神經(jīng)元分離共培養(yǎng)后,神經(jīng)元培養(yǎng)上清中IL-6水平較對照組明顯降低(P0.05),IL-6R、STAT3 m RNA和蛋白表達(dá)水平也較對照組顯著下降(P0.05);但OGD+si IL-6 MSCs和OGD+GFP MSCs兩組中Bax、Bcl-2 m RNA和蛋白表達(dá)水平無明顯差異,兩組神經(jīng)元凋亡情況也無統(tǒng)計學(xué)差異。(4)si IL-6 MSCs移植后,HIBD+si IL-6 MSCs和HIBD+GFP MSCs兩組大鼠腦組織中NSE/Bcl-2共定位表達(dá)亦無明顯區(qū)別。(5)IL-6/STAT3信號通路PCR array檢測結(jié)果表明,OGD+si IL-6 MSCs組神經(jīng)元的IL-6/STAT3信號通路中大部分因子表達(dá)水平均較OGD+GFP MSCs組有所下調(diào),其中SOCS1下調(diào)約4倍,為下調(diào)最明顯的因子。(6)real-time PCR檢測顯示,OGD損傷后的神經(jīng)元與rBMSCs分離共培養(yǎng)后,神經(jīng)元中SOCS1 m RNA表達(dá)水平明顯增高(P0.05),而與si IL-6 MSCs分離共培養(yǎng)后的神經(jīng)元中SOCS1的m RNA表達(dá)水平較對照組顯著降低(P0.05)。(7)ELISA檢測顯示,rBMSCs移植2d和9d后,HIBD大鼠左側(cè)腦組織中IFNγ和IP-10表達(dá)水平均降低(P0.05),而si IL-6 MSCs移植組中的IFNγ和IP-10表達(dá)水平卻較對照組顯著升高(P0.05)。結(jié)論(1)成功培養(yǎng)了可用于后續(xù)實驗的原代胎鼠海馬神經(jīng)元。(2)rBMSCs分離共培養(yǎng)可增加原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清中IL-6水平,激活神經(jīng)元中STAT3信號通路;當(dāng)沉默rBMSCs中IL-6表達(dá)后,si IL-6MSCs分離共培養(yǎng)可降低原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清中IL-6水平,抑制神經(jīng)元中STAT3信號通路;但對神經(jīng)元凋亡均無顯著影響。此結(jié)果在HIBD大鼠體內(nèi)得到進(jìn)一步驗證。(3)rBMSCs來源的IL-6可激活OGD損傷神經(jīng)元中SOCS1表達(dá)水平,抑制HIBD大鼠腦組織中IFNγ和IP-10的分泌。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R742

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本文編號：2371379