【摘要】：大腦皮質發(fā)育障礙(malformation of cortical development, MCD)被看作是兒童藥物難治性癲癇的重為重要的病因之一，其最鮮明的病理特征為大腦皮質板層結構的紊亂及異構神經元的出現(xiàn)。流行病學資料表明，約40%的兒童藥物難治性癲癇是由MCD所致的，同時約75%的MCD患者會發(fā)生癲癇。 MCD是一組病理學表現(xiàn)類似疾病的總稱，主要包括局灶性皮質發(fā)育不良(focalcortical dysplasia, FCD)、結節(jié)性硬化(tuberous sclerosis complex, TSC)、半側巨腦癥、多小腦回及Sturge-Weber綜合征等亞型。而其中又以FCD和TSC最為多見。流行病學數據資料顯示，F(xiàn)CD已成為我國藥物難治性癲癇外科手術治療的首要病因。2011年，國際抗癲癇聯(lián)盟（International league against epilepsy, ILAE）公布了最新版FCD分型標準。將其區(qū)分為孤立型FCD病灶和聯(lián)合型FCD病灶。其中，孤立性FCD又可通過組織病理表現(xiàn)分為FCD I型和FCDII型。FCD I型的主要病理表現(xiàn)包括皮質板層結構的紊亂及肥大神經元（HNs）的出現(xiàn)。FCD II型除包含上述病理結果外，進一步出現(xiàn)異形神經元(DNs)和氣球樣細胞(BCs)，這些異常的細胞被統(tǒng)稱為異構神經元(MCs)。 先前已有大量研究關注了異構神經元的來源及其功能。目前公認的研究理論認為，異構神經元可能是異常的神經遷移、增殖和/或凋亡導致的。電生理研究表明，異形神經元具有高興奮性，可能在癲癇發(fā)作中發(fā)揮重要作用。有趣的是，既往被認為發(fā)揮核心作用的氣球樣細胞，并不能產生動作電位�？傊�，，目前對于異構神經元病理發(fā)生及FCD癲癇發(fā)生過程所知有限，具體機制仍有待闡明。 酸敏感離子通道是一類可被胞外H+激活的非選擇性陽離子離子通道，屬于上皮鈉通道ENaC/退化因子基因DEG通道家族成員，主要通透Na+、Ca2+。目前為止共發(fā)現(xiàn)6種ASIC蛋白亞型，分別由4種ASIC基因編碼而成。ASIC1a是由ACCN2基因編碼的，其在中樞神經系統(tǒng)和周圍神經系統(tǒng)均有廣泛的表達。先前已有大量文獻證實，ASIC1a參與突觸可塑性，學習記憶及恐懼情緒等生理過程。另一方面，ASIC1a在腦缺血，多發(fā)性硬化及癲癇等病理過程中，同樣發(fā)揮重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在顳葉癲癇大鼠模型海馬CA1-2區(qū)，ASIC1a mRNA水平顯著下調。更為重要的是，在體和離體研究均證實，ASIC1a可縮短癲癇發(fā)作時間，抑制癲癇發(fā)作進程。然而另一方面的證據顯示，使用非特異性ASICs阻斷劑Amiloride，可延緩邊緣系統(tǒng)癲癇發(fā)作及癲癇持續(xù)狀態(tài)的發(fā)生。在本課題的預實驗中，我們發(fā)現(xiàn)手術切除的FCD臨床標本中ASIC1a表達下降。那么，ASIC1a在FCD中的具體表達模式如何？下調表達的ASIC1a是否參與FCD病理發(fā)生和癲癇發(fā)生過程呢？這些問題都值得我們進一步關注。 為了闡明ASIC1a在FCD病理發(fā)生中的作用。首先，使用real-timePCR、免疫印跡及免疫組織化學等技術觀察了ASIC1a在臨床FCD標本中的表達和分布；其次，為了了解ASIC1a參與的MCD癲癇發(fā)生過程，我們建立了一種“雙打擊”MCD大鼠模型，利用皮層腦電圖技術，研究了ASIC1a拮抗劑Amiloride對癲癇潛伏期、持續(xù)時間及發(fā)作次數的調節(jié)效應；再次，通過原代培養(yǎng)大腦皮層神經元，我們證實了ASIC1a介導的酸誘導皮層神經元凋亡過程；最后，由于炎性因子可調節(jié)ASIC1a的表達和功能，我們檢測了炎性細胞因子IL-2系統(tǒng)在FCD中的表達。通過上述研究，我們得到以下結果： 一、ASIC1a在CTX和FCD中的表達分布 1．Real-time PCR和Western blot結果顯示，正常大腦皮層中存在ASIC1a mRNA和蛋白的表達，主要分布于錐體神經元和膠質樣細胞上； 2．在FCD皮質勻漿中，ASIC1a mRNA及蛋白水平較正常對照組明顯減弱，F(xiàn)CD II型組織中ASIC1a的表達顯著低于FCD I型。免疫組化結果顯示，F(xiàn)CD皮質中，ASIC1a的免疫反應性顯著降低，主要表達于反應性星形膠質細胞和小部分異構神經元，包括：HNs、DNs及BCs。免疫熒光雙標結果表明:①ASIC1a免疫陽性神經元和反應性星形膠質細胞共表達神經元標記物NeuN以及星形膠質細胞特異性標志物GFAP;②ASIC1a免疫陽性的MCs共表達NeuN，然而未見其共表達GFAP。 3．Western blot結果顯示，F(xiàn)CD皮質組織勻漿中，抑制性中間神經元標志物parvalbumin (PV), calbindin (CB)和calretinin (CR)蛋白表達水平較正常對照組明顯減低。 二、ASIC1a對MCD大鼠癲癇發(fā)作的調節(jié)效應 1．我們使用了孕17天大鼠宮內γ-射線照射，成年后給予腹腔注射戊四氮的方法建立的“雙打擊”MCD大鼠模型。免疫組織化學法檢測發(fā)現(xiàn)，在γ射線照射組、PTZ組及γ-射線+PTZ組，ASIC1a的蛋白表達水平較正常對照組顯著減低。再者，γ射線+PTZ組ASIC1a的表達水平顯著低于γ射線照射組和PTZ組。此外，PTZ組ASIC1a表達水平顯著低于γ射線組。 2．PTZ注射前90分鐘，腹腔注射ASIC通道的非特異性阻滯劑Amiloride。腦電圖結果顯示:①在正常大鼠組中，amiloride并未改變癲癇發(fā)作潛伏期、持續(xù)時間及發(fā)作次數等行為學指標；②而在MCD大鼠組，使用amiloride可延長癲癇發(fā)作潛伏期，而發(fā)作持續(xù)時間顯著縮短。 三、ASIC1a介導的酸誘導的皮層神經元凋亡 1．原代培養(yǎng)小鼠大腦皮層神經元，分別給予不同PH值（PH6.8、PH7.0、PH7.1及PH7.2）的酸性培養(yǎng)基15、30及60分鐘。乳酸脫氫酶檢測結果顯示，酸性培養(yǎng)基誘導皮層神經元LDH的釋放具有明顯的PH依賴及時間依賴性。而使用ASIC拮抗劑Amiloride及PcTX-1，可顯著降低酸誘導的皮層神經元損傷。 2．使用PH6.8的酸性培養(yǎng)基刺激培養(yǎng)的皮層神經元15分鐘，可顯著增加TUNEL陽性的細胞率。而使用Amiloride和PcTX-1可分別減少40%及30%的酸誘導凋亡比率。 3．Western blot結果顯示，酸性培養(yǎng)基刺激培養(yǎng)的皮層神經元后，細胞活化凋亡蛋白Caspase-3表達增高。而Amiloride和PcTX-1可下調酸誘導的Caspase-3的表達。 四、FCD病灶內IL-2系統(tǒng)的表達活化及細胞定位 1．在FCD皮質組織勻漿中，IL-2及其受體IL-2Rs (IL-2Rα, IL-2Rβ, IL-2Rγ)的mRNA及蛋白表達水平較正常對照組明顯增高。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在FCD II型組織中，IL-2及其受體的表達顯著高于FCD I型組織。原位雜交及免疫組化結果顯示，IL-2及其受體在FCD I型組織中，強表達于HNs及細胞微柱；而在FCD II型組織中，強表達于異構神經元。免疫熒光雙標結果顯示：①IL-2及其受體免疫陽性神經元和反應性星形膠質細胞分別與神經元標記物NeuN以及星形膠質細胞特異性標志物GFAP共表達；②FCD病灶中的T細胞表達IL-2及其受體，然而小膠質細胞并未顯示出IL-2及IL-2Rs免疫反應性；3IL-2及其受體陽性的MCs與NeuN共表達，然而未見其于GFAP共表達；4IL-2及其受體陽性的MCs與vimentin共表達。 2．Western blot結果顯示，F(xiàn)CD病灶內IL-2下游信號通路分子JAK1、JAK3及p-STAT5蛋白水平較正常對照組織顯著升高。再者，酶聯(lián)免疫吸附實驗結果顯示，可溶性IL-2受體在FCD病灶內表達降低。上述結果提示，JAK-STAT及可溶性IL-2受體參與MCD的病理發(fā)生過程。 綜上所述，本研究結果表明：第一、臨床FCD標本中ASIC1a表達顯示下調，主要表達于反應性星形膠質細胞及異構神經元；第二、在MCD大鼠模型皮層中ASIC1a表達減低，使用ASIC1a拮抗劑可延長MCD大鼠的癲癇發(fā)作潛伏期，同時縮短發(fā)作持續(xù)時間；第三、使用ASIC1a拮抗劑可顯著降低酸誘導的LDH含量、TUNEL陽性的神經元數量及凋亡蛋白caspase-3的表達，提示ASIC1a介導了酸誘導的皮層神經元凋亡；第四、炎性因子IL-2及其受體IL-2Rs(IL-2Rα, IL-2Rβ, IL-2Rγ)在FCD病灶中表達上調，而其下游信號通路JAK-STAT相關信號分子激活，提示IL-2可能通過JAK-STAT通路參與FCD的病理發(fā)生過程�？傊鲜鼋Y果有力提示ASIC1a參與MCD的病理發(fā)生機癲癇發(fā)生過程。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R742.1

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本文編號：2371223