【摘要】：大腦皮質(zhì)發(fā)育障礙(malformation of cortical development, MCD)被看作是兒童藥物難治性癲癇的重為重要的病因之一，其最鮮明的病理特征為大腦皮質(zhì)板層結(jié)構(gòu)的紊亂及異構(gòu)神經(jīng)元的出現(xiàn)。流行病學(xué)資料表明，約40%的兒童藥物難治性癲癇是由MCD所致的，同時約75%的MCD患者會發(fā)生癲癇。 MCD是一組病理學(xué)表現(xiàn)類似疾病的總稱，主要包括局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良(focalcortical dysplasia, FCD)、結(jié)節(jié)性硬化(tuberous sclerosis complex, TSC)、半側(cè)巨腦癥、多小腦回及Sturge-Weber綜合征等亞型。而其中又以FCD和TSC最為多見。流行病學(xué)數(shù)據(jù)資料顯示，F(xiàn)CD已成為我國藥物難治性癲癇外科手術(shù)治療的首要病因。2011年，國際抗癲癇聯(lián)盟（International league against epilepsy, ILAE）公布了最新版FCD分型標(biāo)準(zhǔn)。將其區(qū)分為孤立型FCD病灶和聯(lián)合型FCD病灶。其中，孤立性FCD又可通過組織病理表現(xiàn)分為FCD I型和FCDII型。FCD I型的主要病理表現(xiàn)包括皮質(zhì)板層結(jié)構(gòu)的紊亂及肥大神經(jīng)元（HNs）的出現(xiàn)。FCD II型除包含上述病理結(jié)果外，進(jìn)一步出現(xiàn)異形神經(jīng)元(DNs)和氣球樣細(xì)胞(BCs)，這些異常的細(xì)胞被統(tǒng)稱為異構(gòu)神經(jīng)元(MCs)。 先前已有大量研究關(guān)注了異構(gòu)神經(jīng)元的來源及其功能。目前公認(rèn)的研究理論認(rèn)為，異構(gòu)神經(jīng)元可能是異常的神經(jīng)遷移、增殖和/或凋亡導(dǎo)致的。電生理研究表明，異形神經(jīng)元具有高興奮性，可能在癲癇發(fā)作中發(fā)揮重要作用。有趣的是，既往被認(rèn)為發(fā)揮核心作用的氣球樣細(xì)胞，并不能產(chǎn)生動作電位�？傊�，目前對于異構(gòu)神經(jīng)元病理發(fā)生及FCD癲癇發(fā)生過程所知有限，具體機(jī)制仍有待闡明。 酸敏感離子通道是一類可被胞外H+激活的非選擇性陽離子離子通道，屬于上皮鈉通道ENaC/退化因子基因DEG通道家族成員，主要通透Na+、Ca2+。目前為止共發(fā)現(xiàn)6種ASIC蛋白亞型，分別由4種ASIC基因編碼而成。ASIC1a是由ACCN2基因編碼的，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)均有廣泛的表達(dá)。先前已有大量文獻(xiàn)證實(shí)，ASIC1a參與突觸可塑性，學(xué)習(xí)記憶及恐懼情緒等生理過程。另一方面，ASIC1a在腦缺血，多發(fā)性硬化及癲癇等病理過程中，同樣發(fā)揮重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在顳葉癲癇大鼠模型海馬CA1-2區(qū)，ASIC1a mRNA水平顯著下調(diào)。更為重要的是，在體和離體研究均證實(shí)，ASIC1a可縮短癲癇發(fā)作時間，抑制癲癇發(fā)作進(jìn)程。然而另一方面的證據(jù)顯示，使用非特異性ASICs阻斷劑Amiloride，可延緩邊緣系統(tǒng)癲癇發(fā)作及癲癇持續(xù)狀態(tài)的發(fā)生。在本課題的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)手術(shù)切除的FCD臨床標(biāo)本中ASIC1a表達(dá)下降。那么，ASIC1a在FCD中的具體表達(dá)模式如何？下調(diào)表達(dá)的ASIC1a是否參與FCD病理發(fā)生和癲癇發(fā)生過程呢？這些問題都值得我們進(jìn)一步關(guān)注。 為了闡明ASIC1a在FCD病理發(fā)生中的作用。首先，使用real-timePCR、免疫印跡及免疫組織化學(xué)等技術(shù)觀察了ASIC1a在臨床FCD標(biāo)本中的表達(dá)和分布；其次，為了了解ASIC1a參與的MCD癲癇發(fā)生過程，我們建立了一種“雙打擊”MCD大鼠模型，利用皮層腦電圖技術(shù)，研究了ASIC1a拮抗劑Amiloride對癲癇潛伏期、持續(xù)時間及發(fā)作次數(shù)的調(diào)節(jié)效應(yīng)；再次，通過原代培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元，我們證實(shí)了ASIC1a介導(dǎo)的酸誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元凋亡過程；最后，由于炎性因子可調(diào)節(jié)ASIC1a的表達(dá)和功能，我們檢測了炎性細(xì)胞因子IL-2系統(tǒng)在FCD中的表達(dá)。通過上述研究，我們得到以下結(jié)果： 一、ASIC1a在CTX和FCD中的表達(dá)分布 1．Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示，正常大腦皮層中存在ASIC1a mRNA和蛋白的表達(dá)，主要分布于錐體神經(jīng)元和膠質(zhì)樣細(xì)胞上； 2．在FCD皮質(zhì)勻漿中，ASIC1a mRNA及蛋白水平較正常對照組明顯減弱，F(xiàn)CD II型組織中ASIC1a的表達(dá)顯著低于FCD I型。免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)CD皮質(zhì)中，ASIC1a的免疫反應(yīng)性顯著降低，主要表達(dá)于反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和小部分異構(gòu)神經(jīng)元，包括：HNs、DNs及BCs。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果表明:①ASIC1a免疫陽性神經(jīng)元和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN以及星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP;②ASIC1a免疫陽性的MCs共表達(dá)NeuN，然而未見其共表達(dá)GFAP。 3．Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)CD皮質(zhì)組織勻漿中，抑制性中間神經(jīng)元標(biāo)志物parvalbumin (PV), calbindin (CB)和calretinin (CR)蛋白表達(dá)水平較正常對照組明顯減低。 二、ASIC1a對MCD大鼠癲癇發(fā)作的調(diào)節(jié)效應(yīng) 1．我們使用了孕17天大鼠宮內(nèi)γ-射線照射，成年后給予腹腔注射戊四氮的方法建立的“雙打擊”MCD大鼠模型。免疫組織化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)，在γ射線照射組、PTZ組及γ-射線+PTZ組，ASIC1a的蛋白表達(dá)水平較正常對照組顯著減低。再者，γ射線+PTZ組ASIC1a的表達(dá)水平顯著低于γ射線照射組和PTZ組。此外，PTZ組ASIC1a表達(dá)水平顯著低于γ射線組。 2．PTZ注射前90分鐘，腹腔注射ASIC通道的非特異性阻滯劑Amiloride。腦電圖結(jié)果顯示:①在正常大鼠組中，amiloride并未改變癲癇發(fā)作潛伏期、持續(xù)時間及發(fā)作次數(shù)等行為學(xué)指標(biāo)；②而在MCD大鼠組，使用amiloride可延長癲癇發(fā)作潛伏期，而發(fā)作持續(xù)時間顯著縮短。 三、ASIC1a介導(dǎo)的酸誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡 1．原代培養(yǎng)小鼠大腦皮層神經(jīng)元，分別給予不同PH值（PH6.8、PH7.0、PH7.1及PH7.2）的酸性培養(yǎng)基15、30及60分鐘。乳酸脫氫酶檢測結(jié)果顯示，酸性培養(yǎng)基誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元LDH的釋放具有明顯的PH依賴及時間依賴性。而使用ASIC拮抗劑Amiloride及PcTX-1，可顯著降低酸誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元損傷。 2．使用PH6.8的酸性培養(yǎng)基刺激培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元15分鐘，可顯著增加TUNEL陽性的細(xì)胞率。而使用Amiloride和PcTX-1可分別減少40%及30%的酸誘導(dǎo)凋亡比率。 3．Western blot結(jié)果顯示，酸性培養(yǎng)基刺激培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元后，細(xì)胞活化凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)增高。而Amiloride和PcTX-1可下調(diào)酸誘導(dǎo)的Caspase-3的表達(dá)。 四、FCD病灶內(nèi)IL-2系統(tǒng)的表達(dá)活化及細(xì)胞定位 1．在FCD皮質(zhì)組織勻漿中，IL-2及其受體IL-2Rs (IL-2Rα, IL-2Rβ, IL-2Rγ)的mRNA及蛋白表達(dá)水平較正常對照組明顯增高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在FCD II型組織中，IL-2及其受體的表達(dá)顯著高于FCD I型組織。原位雜交及免疫組化結(jié)果顯示，IL-2及其受體在FCD I型組織中，強(qiáng)表達(dá)于HNs及細(xì)胞微柱；而在FCD II型組織中，強(qiáng)表達(dá)于異構(gòu)神經(jīng)元。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示：①IL-2及其受體免疫陽性神經(jīng)元和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞分別與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN以及星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP共表達(dá)；②FCD病灶中的T細(xì)胞表達(dá)IL-2及其受體，然而小膠質(zhì)細(xì)胞并未顯示出IL-2及IL-2Rs免疫反應(yīng)性；3IL-2及其受體陽性的MCs與NeuN共表達(dá)，然而未見其于GFAP共表達(dá)；4IL-2及其受體陽性的MCs與vimentin共表達(dá)。 2．Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)CD病灶內(nèi)IL-2下游信號通路分子JAK1、JAK3及p-STAT5蛋白水平較正常對照組織顯著升高。再者，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，可溶性IL-2受體在FCD病灶內(nèi)表達(dá)降低。上述結(jié)果提示，JAK-STAT及可溶性IL-2受體參與MCD的病理發(fā)生過程。 綜上所述，本研究結(jié)果表明：第一、臨床FCD標(biāo)本中ASIC1a表達(dá)顯示下調(diào)，主要表達(dá)于反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞及異構(gòu)神經(jīng)元；第二、在MCD大鼠模型皮層中ASIC1a表達(dá)減低，使用ASIC1a拮抗劑可延長MCD大鼠的癲癇發(fā)作潛伏期，同時縮短發(fā)作持續(xù)時間；第三、使用ASIC1a拮抗劑可顯著降低酸誘導(dǎo)的LDH含量、TUNEL陽性的神經(jīng)元數(shù)量及凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)，提示ASIC1a介導(dǎo)了酸誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡；第四、炎性因子IL-2及其受體IL-2Rs(IL-2Rα, IL-2Rβ, IL-2Rγ)在FCD病灶中表達(dá)上調(diào)，而其下游信號通路JAK-STAT相關(guān)信號分子激活，提示IL-2可能通過JAK-STAT通路參與FCD的病理發(fā)生過程。總之，上述結(jié)果有力提示ASIC1a參與MCD的病理發(fā)生機(jī)癲癇發(fā)生過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R742.1

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