【摘要】：背景:氧化應(yīng)急損傷是腦缺血再灌注病理改變過程中的一個重要組成部分。核轉(zhuǎn)錄因子(NF-E2-related factor 2,Nrf2)在這個損傷過程中對神經(jīng)元起到了保護作用。Glycogen synthase kinase 3β(GSK-3β)被證明能夠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)外修飾Nrf2在細胞中的胞漿結(jié)合蛋白(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein1,Keap1),導致更多Nrf2從細胞核釋放到胞漿,引起下游蛋白的一系列變化。從而加重細胞的損傷。但是還沒有研究討論GSK-3β在腦缺血再灌注中是否對中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元有類似的損傷作用。也沒有研究表明,在腦缺血灌注過程中,GSK-3β與Nrf2的相互作用關(guān)系。目的:構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷的體內(nèi)外模型,從分子、細胞及動物水平探討GSK-3β在氧化應(yīng)激損傷中對腦神經(jīng)元的作用機制和相關(guān)信號傳導的影響。方法:(1)培養(yǎng)取自新生SD大鼠腦組織的皮質(zhì)神經(jīng)元。建立原代神經(jīng)元氧糖剝奪/復氧(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型。(2)構(gòu)建GSK-3βRNAi慢病毒載體和GSK-3β過表達慢病毒載體,并感染OGD/R模型。根據(jù)是否進行GSK-3β干擾(GSK-3βRNAi)和是否建立OGD/R,進行分組。并加入對照組、vector組(空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組)、GSK-3β過表達(GSK-3βoverexpression)組、姜黃素治療(curcumin-treated)組、vector+氧糖剝奪/復氧(vector+OGD/R)組、GSK-3βRNAi+氧糖剝奪/復氧(GSK-3βRNAi+OGD/R)組、姜黃素治療+氧糖剝奪/復氧(curcumin-treated+OGD/R)組、輕肌蛋白B治療+氧糖剝奪/復氧(leptomycin B-treated+OGD/R)組和GSK-3β過表達+輕肌蛋白B治療+氧糖剝奪/復氧(GSK-3βoverexpression+leptomycin B-treated+OGD/R)組。(3)熒光顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)和轉(zhuǎn)染效率,用q RT-PCR檢測確定干擾和過表達。(4)采用比色法細胞繁殖定量檢測MTS試劑盒和LDH試劑盒檢測細胞活性及細胞損傷程度。采用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒和丙二醛(Malondialdehycle,MDA)試劑盒檢測神經(jīng)元的SOD和MDA的水平,分析細胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)。采用Western Blot及免疫熒光的方法,進一步檢測GSK-3β的表達與Nrf2水平之間的關(guān)系。(5)建立成年雄性SD大鼠大腦中動脈阻塞模型(middle cerebral artery occlusion,MCAO模型)在動物體內(nèi)模擬腦缺血再灌注損傷過程。構(gòu)建化學合成的GSK-3βRNAi片段,于造模前48小時行側(cè)腦室注射。(6)觀察在MCAO模型建立后,GSK-3βRNAi對大鼠的神經(jīng)功能、腦梗死面積、腦組織含水量及梗死灶皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)學的影響。通過對比各組大鼠腦組織勻漿中SOD、MDA的水平,評價在大鼠腦缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷中GSK-3β的作用。采用Western Blot及免疫熒光的方法,進一步檢測GSK-3β的表達與Nrf2水平之間的關(guān)系。結(jié)果:GSK-3βRNAi減輕了OGD/R模型中神經(jīng)元的損傷和減輕了細胞活性。并導致總Nrf2、核Nrf2,以及Nrf2下游蛋白sulfiredoxin1(Srx1)和thioredoxin1(Trx1)的升高。相反的,過表達GSK-3β后,得到相反的結(jié)果。腦室內(nèi)注射GSK-3βsi RNA慢病毒片段能減輕MCAO模型神經(jīng)功能損傷,減小腦梗塞面積和含水量。提高了MCAO模型腦皮質(zhì)Nrf2、Srx1和Trx1水平。結(jié)論:GSK-3β通過改變Nrf2核內(nèi)外分布,促進Nrf2轉(zhuǎn)移到胞漿,降低Nrf2及其下游蛋白Srx1和Trx1水平,加重腦缺血再灌注損傷。這些結(jié)果為腦卒中的治療提供了新的思考方向。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R743.3

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本文編號：2370972