【摘要】：異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase）IDH1基因定位于2q33.3染色體上，全長18,841bp，其中包括9個內(nèi)含子和10個外顯子；IDH2基因定位于15q26.1，全長18,498bp，其中包括11個內(nèi)含子和12個外顯子。它們編碼的異檸檬酸脫氫酶參與TCA循環(huán)，催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸，與細胞缺氧誘導因子（HIF）的穩(wěn)定性相關，而HIF表達與腫瘤不同的惡性行為相關。已有文獻報道在大部分膠質(zhì)瘤中有IDH基因突變的患者有良好的預后效果。因此通過檢測IDH突變可對膠質(zhì)瘤患者的預后作出一定的預測，對臨床工作有指導意義。 本文擬通過提取膠質(zhì)瘤石蠟包埋組織DNA，優(yōu)化PCR反應條件，初步建立IDH基因突變高分辨率熔解曲線（high resolution melting, HRM）檢測方法，驗證反應體系的檢測靈敏度和穩(wěn)定性。通過與DNA直接測序法和免疫組化法的比較，統(tǒng)計分析標本參數(shù)與qPCR-HRM檢測IDH1基因突變結果的相關性，探討qPCR-HRM法檢測IDH基因突變的優(yōu)勢和臨床應用的可行性。 首先對HRM檢測技術參數(shù)進行優(yōu)化：提取腦膠質(zhì)瘤患者石蠟包埋組織標本標本中DNA，采用溫度梯度PCR、正交設計和響應面實驗，優(yōu)化IDH的qPCR-HRM反應體系和反應條件。分別將IDH基因野生型和突變型DNA梯度混合稀釋，進行qPCR-HRM反應，并將擴增產(chǎn)物進行DNA直接測序，比較兩種方法的最低檢出限。將IDH突變型和野生型膠質(zhì)瘤標本同時重復檢測15次；以及每隔30天檢測一次，共檢測3次，，觀察qPCR-HRM方法的重復性。將IDH基因突變型DNA依次稀釋后進行qPCR-HRM檢測，分析最低檢測模板量。 其次是對51例人膠質(zhì)瘤標本進行IDH基因突變檢測：對石蠟包埋組織標本進行切片，行HE染色和IDH1免疫組化檢測；提取膠質(zhì)瘤組織DNA，按照優(yōu)化的qPCR-HRM反應條件進行IDH基因突變檢測，并與DNA直接測序法比較。觀察統(tǒng)計分析標本中腫瘤細胞數(shù)量、患者年齡、性別和膠質(zhì)瘤分級與突變檢出結果之間的相關性并進行統(tǒng)計學分析。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理分析，組間檢出率的比較采用卡方檢驗，多因素與突變檢出結果的相關性分析采用logistic回歸分析，選取檢驗水準α=0.05。 結果顯示：IDH1基因的qPCR最佳退火溫度為53℃，20μl反應體系中最佳反應體系為：引物濃度為0.6μmol/L，Mg2+為2.5mmol/L，模板DNA為60ng。IDH2基因響應面 分析結果證明20μL qPCR-HRM反應體系中，引物濃度0.6umol/l，模板量45ng，Mg2+濃度2.75mmol/l，退火溫度52.5℃為最佳。IDH1和IDH2qPCR-HRM法的最低檢出限分別為0.5%、1%；IDH1和IDH2直接測序法的最低檢出限分別為40%、80%，提示qPCR-HRM方法比直接測序法靈敏度高。IDH1和IDH2的qPCR-HRM重復性檢測顯示批內(nèi)批間的重復性良好。qPCR-HRM方法檢測IDH1和IDH2基因的DNA模板量最低分別為0.5ng和1ng。在51例人膠質(zhì)瘤標本中，qPCR-HRM法共檢測出33例腦膠質(zhì)瘤石蠟組織標本為IDH1基因突變型，2例腦膠質(zhì)瘤石蠟組織標本為IDH2基因突變型，其余均為野生型。經(jīng)統(tǒng)計分析IDH基因突變的HRM檢測結果與DNA直接測序和免疫組化檢測法一致。logistic回歸分析結果表明標本腫瘤細胞數(shù)量、患者年齡、性別與IDH1基因突變檢出率有顯著性關系（P＞0.05）。 綜上所述，本研究建立的腦膠質(zhì)瘤IDH基因突變qPCR-HRM檢測方法具有靈敏度高，重復性好，操作簡便，結果準確特點，將為臨床膠質(zhì)瘤石蠟包埋組織標本IDH基因突變的檢測提供了一種新方法。
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【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

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1 王銀輝;張海燕;楊傳紅;張偉;賴晃文;陳曉東;王捷;;腦膠質(zhì)瘤IDH1基因突變HRM檢測方法的初步建立[J];生命科學研究;2013年05期

2 王銀輝;張海燕;楊傳紅;張偉;賴晃文;陳曉東;王捷;;腦膠質(zhì)瘤IDH2基因突變HRM檢測方法的初步建立[J];中國生物工程雜志;2013年12期

本文編號：2369368