【摘要】：目的:觀察SD大鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells,BMSCs-NSCs)在血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells,VEC)培養(yǎng)條件下是否分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞(endothelial-like cells,ELCs)。方法:本實(shí)驗(yàn)采用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠雙側(cè)股骨、脛骨以及肱骨的骨髓,利用骨髓源基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的貼壁生長(zhǎng)特性和多次傳代培養(yǎng)使其純化。研究BMSCs的外形改變并繪制P3(Passage 3)代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線,探討B(tài)MSCs的最適接種密度,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs標(biāo)志物CD34、CD44、CD45、CD90的表達(dá)情況。將所得P3代BMSCs消化形成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度后置于神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(20ng/mL bFGF、20ng/mL EGF、B27)中進(jìn)行懸浮培養(yǎng),通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察神經(jīng)球表面標(biāo)志物CD133、Nestin的表達(dá)情況。培養(yǎng)所得神經(jīng)球消化形成單細(xì)胞,并進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)VEC表面標(biāo)志物CD31、vWF的表達(dá)情況。將所得NSCs懸液置于Matrigel膠質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng),觀察是否形成血管腔樣結(jié)構(gòu)。結(jié)果:1.BMSCs早期呈簇狀生長(zhǎng),細(xì)胞呈梭形。P3 BMSCs流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示CD44陽(yáng)性細(xì)胞比率為91.4%,CD90陽(yáng)性細(xì)胞比率為93.7%;CD34、CD45的表達(dá)均呈陰性反應(yīng)。2.P3代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”型,其接種最佳密度區(qū)間在5×104~1×105/mL。3.BMSCs培養(yǎng)1-2天時(shí)細(xì)胞聚集呈團(tuán)塊狀,隨后呈“桑葚狀”球形結(jié)構(gòu),免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示CD133、Nestin的表達(dá)均呈陽(yáng)性反應(yīng)。4.骨髓源神經(jīng)球在VEC培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天時(shí),細(xì)胞呈扁平狀,三角形或多角形,外觀似“鋪路石”狀。在Matrigel膠質(zhì)培養(yǎng)基中可形成管腔樣結(jié)構(gòu)。結(jié)論:1.體外利用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法,可將大鼠BMSCs誘導(dǎo)分化為NSCs。2.BMSCs-NSCs體外誘導(dǎo)可定向分化為ELCs,并且在Matrigel膠中可形成管腔樣結(jié)構(gòu)。
[Abstract]:Aim: to investigate the differentiation of SD rat bone marrow derived neural stem cells (bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells,BMSCs-NSCs) into endothelioid cells (endothelial-like cells,ELCs) in cultured vascular endothelial cells (vascular endothelial cells,VEC). Methods: the bone marrow of bilateral femur, tibia and humerus were isolated and cultured by whole bone marrow culture method. The adherent growth characteristics of bone marrow derived stromal cells (bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs) and the purification of the bone marrow derived stem cells (bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs) were obtained. The shape change of BMSCs was studied and the growth curve of P3 (Passage 3) generation cells was plotted. The optimal inoculation density of BMSCs was discussed. The expression of BMSCs marker CD34,CD44,CD45,CD90 was detected by flow cytometry. The P3 passage BMSCs was digested to form a single cell suspension, and the cell density was adjusted and then cultured in a neural stem cell (neural stem cells,NSCs (20ng/mL bFGF,20ng/mL EGF,B27) induction medium. The expression of CD133,Nestin was observed by immunocytochemical staining. The cultured neurospheres were digested to form single cells and the expression of CD31,vWF on the surface of VEC was detected by immunocytochemical staining. The obtained NSCs suspension was cultured in Matrigel glial medium to observe whether the vascular lumen structure was formed. Results: in the early stage of 1.BMSCs, the cells grew in clusters and the cells were fusiform. P3 BMSCs flow cytometry showed that the ratio of CD44 positive cells was 91.4 and that of CD90 positive cells was 93.7. The expression of CD34,CD45 was negative. The growth curve of 2.P3 cells was "S" type, and the best density of 2.P3 was "mulberry" globular structure after 1-2 days of incubation with 5 脳 10 ~ 4 ~ 1 脳 105/mL.3.BMSCs. Immunocytochemical staining showed that the expression of CD133,Nestin was positive. 4. 4. When cultured in VEC medium for 7 days, the cells were flattened, triangular or polygonal, and looked like paving stones. The lumen like structure can be formed in Matrigel colloid medium. Conclusion: 1. Rat BMSCs could be induced to differentiate into NSCs.2.BMSCs-NSCs by serum-free suspension culture in vitro, and could be induced to differentiate into ELCs, in vitro. The tubular structure could be formed in Matrigel gel.
【學(xué)位授予單位】：青海大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R741

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本文編號(hào)：2365041