發(fā)布時(shí)間：2018-11-22 13:15

【摘要】：第一部分花青素拮抗順鉑誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性及機(jī)制研究研究背景順鉑作為一線抗腫瘤藥物被廣泛應(yīng)用于臨床上治療多種腫瘤,但因其神經(jīng)毒性等嚴(yán)重的毒副作用,嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。眾所周知,順鉑能夠引起神經(jīng)毒性,氧化應(yīng)激在其中的作用仍不是很清楚。很多研究證實(shí),順鉑依賴性的化療可引起外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性,其機(jī)制可能涉及ROS清除障礙、產(chǎn)生和蓄積,DNA損傷、炎癥及線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡等機(jī)制。花青素是一種天然的,廣泛存在的類黃酮物質(zhì),抗氧化活性強(qiáng)。因此,我們本部分我們?cè)u(píng)價(jià)花青素體外拮抗順鉑誘導(dǎo)的的PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性,并且探討其可能的機(jī)制。研究目的研究順鉑誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性模型,探討花青素在此過(guò)程中的保護(hù)作用和機(jī)制。研究方法PC12細(xì)胞接種至96孔板,2.5-40μM的順鉑或10-80μM的花青素處理24小時(shí),花青素治療組在花青素預(yù)處理3小時(shí)再加順鉑。MTT的方法檢測(cè)細(xì)胞活性；流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡和周期分布；用TUNEL-DAPI共染色檢測(cè)染色質(zhì)濃縮和斷裂；Caspase螢火光底物檢測(cè)Caspase-3活性；DCFH-DA探針檢測(cè)ROS的含量;Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PARP、Caspase-3、Ser15-p53、Serl39-H2A等蛋白表達(dá)。結(jié)果花青素預(yù)處理可以顯著減輕順鉑誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞死亡和改善形態(tài)學(xué)改變；TUNEL-DAPI染色發(fā)現(xiàn)花青素預(yù)處理能減輕順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡特征；流式結(jié)果顯示花青素顯著減弱順鉑誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡,表現(xiàn)為Sub-G1峰的降低；機(jī)制上,花青素預(yù)處理可顯著減弱順鉑誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞Caspase-3的激活和PARP的切割,抑制ROS產(chǎn)生；此外,花青素預(yù)處理顯著減弱了順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷,表現(xiàn)為Ser15-p53和Ser139-H2A磷酸化水平的降低。結(jié)論花青素預(yù)處理可顯著減弱順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和凋亡,證明其可以作為一種潛在的臨床藥物用于減弱腫瘤化療帶來(lái)的神經(jīng)毒性。第二部分花青素拮抗Ap誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性的機(jī)制研究研究背景Aβ誘導(dǎo)的氧化損傷被認(rèn)為是阿爾茨海默病的主要病生特點(diǎn),Ap誘導(dǎo)的氧化損傷產(chǎn)生ROS的積蓄,蛋白損傷、細(xì)胞膜磷脂和DNA破壞,最終,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,神經(jīng)功能缺失。抑制Ap誘導(dǎo)的氧化損傷被認(rèn)為是對(duì)抗AD的有效治療措施。有著抗氧化損傷活性的各類藥物,應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病治療的時(shí)候有很大潛力。有實(shí)驗(yàn)證明花青素可以清除機(jī)體產(chǎn)生的過(guò)量ROS,并拮抗ROS引起的DNA損傷,能有效對(duì)抗氧化損傷介導(dǎo)的神經(jīng)退行性病變。然而這一藥理學(xué)作用的具體機(jī)制尚不清楚,因此我們研究了花青素對(duì)Ap誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性的保護(hù)作用并其可能機(jī)制進(jìn)行了初步探討。研究目的成立Ap誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型,探討花青素在此過(guò)程中的作用。研究方法PC12細(xì)胞接種至96孔板,Aβ25-35用PBS溶解并37℃孵育3天,花青素(20,40,80μM)預(yù)處理24 h后加A β(10 μM)共處理24h。MTT法測(cè)細(xì)胞活存活能力,TUNEL-DAPI共染法染核,觀察DNA分裂。JC-1探針?lè)z測(cè)線粒體膜電位(△Ψm),采用Ac-DEVD-AMC底物檢測(cè)Caspase-3活性,ROS蓄積用DCFH-DA法分析使用MDm5e酶標(biāo)儀檢測(cè)。Westernblot法檢測(cè)Bax, Bcl-2, Ser139-H2A, p53等蛋白表達(dá)。結(jié)果花青素可以顯著減少了Ap誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞死亡；花青素預(yù)處理顯著減弱Ap誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,表現(xiàn)為染色質(zhì)斷裂和濃縮的減弱、Caspase-3活性的降低和Caspase-3切割的減弱；western blot 和 JC-1結(jié)果表明：花青素預(yù)處理可通過(guò)調(diào)控Bcl-2家族蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)線粒體膜電位；此外,花青素預(yù)處理通過(guò)減弱自由基的產(chǎn)生,顯著減弱了Ap誘導(dǎo)的DNA損傷,表現(xiàn)為Ser15-p53 和 Ser139-H2A磷酸化水平的下降。結(jié)論從機(jī)制上講,花青素通過(guò)影響B(tài)cl-2家族蛋白含量的變化、穩(wěn)定線粒體膜電位,從而有效阻斷了Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。此外,花青素還通過(guò)抑制ROS的生成和大量蓄積而防止PC12細(xì)胞因暴露于Aβ而導(dǎo)致的DNA損傷。均提示花青素可以作為一種藥物用于預(yù)防和治療氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)毒性損傷,具有作為一種有效治療或延緩臨床常見神經(jīng)退行性疾病進(jìn)程的巨大潛力。第三部分花青素對(duì)光化學(xué)法誘導(dǎo)的小鼠局灶性腦缺血模型的保護(hù)作用及其機(jī)制研究研究背景缺血性卒中通過(guò)氧化應(yīng)激這一機(jī)制導(dǎo)致了神經(jīng)損傷。很多研究證實(shí),腦缺血引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷與缺血引起機(jī)體應(yīng)激導(dǎo)致的過(guò)氧化損傷后ROS清除障礙、產(chǎn)生和蓄積過(guò)多進(jìn)一步引起DNA損傷、炎癥及線粒體功能障礙從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等機(jī)制有關(guān)。主要組分為類黃酮的花青素抗氧化能力極強(qiáng),因此,我們研究花青素對(duì)缺血性腦卒中引起的神經(jīng)毒性的保護(hù)作用并且探討其可能的機(jī)制。研究目的建立光化學(xué)法誘導(dǎo)的小鼠局灶性腦缺血模型,探討花青素預(yù)處理在此過(guò)程中的保護(hù)作用及其機(jī)制。研究方法Moor多普勒檢測(cè)局部腦血流量、進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、評(píng)估腦功能損傷情況輕重,測(cè)定梗死體積;TUNEL-DAPI共同染凋亡,腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)含量如ROS、SOD、MDA的含量熒光探針及比色法采用用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè),Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PARP、Caspase-3、HO-1、Nrf-2等蛋白含量。結(jié)果花青素預(yù)處理可以顯著增加成模小鼠局部腦血流量,改善腦缺血小鼠神經(jīng)功能及行為學(xué)評(píng)分,梗死體積縮小、。 TUNEL和DAPI染色發(fā)現(xiàn)花青素預(yù)處理能減輕腦缺血小鼠腦組織內(nèi)細(xì)胞凋亡的特征表達(dá),減輕了Caspase-3激活和PARP分裂；顯著抑制ROS的生成降低了MDA的含量,SOD含量增加,HO-1、Nrf-2蛋白表達(dá)水平增高。結(jié)論花青素預(yù)處理對(duì)局灶性腦缺血小鼠腦組織具有明顯的保護(hù)作用,其主要機(jī)制可能與花青素預(yù)處理減少ROS蓄積及脂質(zhì)過(guò)氧化,機(jī)體的抗氧化損傷機(jī)能加強(qiáng),DNA損傷減弱,而且顯著抑制了細(xì)胞凋亡等機(jī)制有關(guān)�？梢娀ㄇ嗨刈鳛橐环N天然抗氧化劑及凋亡抑制劑,在臨床缺血性腦卒中的預(yù)防和治療應(yīng)用中具有巨大潛力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R741

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本文編號(hào)：2349476