【摘要】：第一部分花青素拮抗順鉑誘導的PC12細胞毒性及機制研究研究背景順鉑作為一線抗腫瘤藥物被廣泛應用于臨床上治療多種腫瘤,但因其神經(jīng)毒性等嚴重的毒副作用,嚴重限制了其臨床應用。眾所周知,順鉑能夠引起神經(jīng)毒性,氧化應激在其中的作用仍不是很清楚。很多研究證實,順鉑依賴性的化療可引起外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性,其機制可能涉及ROS清除障礙、產(chǎn)生和蓄積,DNA損傷、炎癥及線粒體功能障礙、細胞凋亡等機制�；ㄇ嗨厥且环N天然的,廣泛存在的類黃酮物質,抗氧化活性強。因此,我們本部分我們評價花青素體外拮抗順鉑誘導的的PC12細胞神經(jīng)毒性,并且探討其可能的機制。研究目的研究順鉑誘導的PC12細胞神經(jīng)毒性模型,探討花青素在此過程中的保護作用和機制。研究方法PC12細胞接種至96孔板,2.5-40μM的順鉑或10-80μM的花青素處理24小時,花青素治療組在花青素預處理3小時再加順鉑。MTT的方法檢測細胞活性；流式細胞儀檢測凋亡和周期分布；用TUNEL-DAPI共染色檢測染色質濃縮和斷裂；Caspase螢火光底物檢測Caspase-3活性；DCFH-DA探針檢測ROS的含量;Western blot檢測細胞內(nèi)PARP、Caspase-3、Ser15-p53、Serl39-H2A等蛋白表達。結果花青素預處理可以顯著減輕順鉑誘導的PC12細胞死亡和改善形態(tài)學改變；TUNEL-DAPI染色發(fā)現(xiàn)花青素預處理能減輕順鉑誘導的細胞凋亡特征；流式結果顯示花青素顯著減弱順鉑誘導的PC12細胞凋亡,表現(xiàn)為Sub-G1峰的降低；機制上,花青素預處理可顯著減弱順鉑誘導的PC12細胞Caspase-3的激活和PARP的切割,抑制ROS產(chǎn)生；此外,花青素預處理顯著減弱了順鉑誘導的DNA損傷,表現(xiàn)為Ser15-p53和Ser139-H2A磷酸化水平的降低。結論花青素預處理可顯著減弱順鉑誘導的細胞毒性和凋亡,證明其可以作為一種潛在的臨床藥物用于減弱腫瘤化療帶來的神經(jīng)毒性。第二部分花青素拮抗Ap誘導PC12細胞神經(jīng)毒性的機制研究研究背景Aβ誘導的氧化損傷被認為是阿爾茨海默病的主要病生特點,Ap誘導的氧化損傷產(chǎn)生ROS的積蓄,蛋白損傷、細胞膜磷脂和DNA破壞,最終,導致細胞凋亡,神經(jīng)功能缺失。抑制Ap誘導的氧化損傷被認為是對抗AD的有效治療措施。有著抗氧化損傷活性的各類藥物,應用于神經(jīng)退行性疾病治療的時候有很大潛力。有實驗證明花青素可以清除機體產(chǎn)生的過量ROS,并拮抗ROS引起的DNA損傷,能有效對抗氧化損傷介導的神經(jīng)退行性病變。然而這一藥理學作用的具體機制尚不清楚,因此我們研究了花青素對Ap誘導PC12細胞神經(jīng)毒性的保護作用并其可能機制進行了初步探討。研究目的成立Ap誘導的PC12細胞損傷模型,探討花青素在此過程中的作用。研究方法PC12細胞接種至96孔板,Aβ25-35用PBS溶解并37℃孵育3天,花青素(20,40,80μM)預處理24 h后加A β(10 μM)共處理24h。MTT法測細胞活存活能力,TUNEL-DAPI共染法染核,觀察DNA分裂。JC-1探針法檢測線粒體膜電位(△Ψm),采用Ac-DEVD-AMC底物檢測Caspase-3活性,ROS蓄積用DCFH-DA法分析使用MDm5e酶標儀檢測。Westernblot法檢測Bax, Bcl-2, Ser139-H2A, p53等蛋白表達。結果花青素可以顯著減少了Ap誘導的PC12細胞死亡；花青素預處理顯著減弱Ap誘導的細胞凋亡,表現(xiàn)為染色質斷裂和濃縮的減弱、Caspase-3活性的降低和Caspase-3切割的減弱；western blot 和 JC-1結果表明：花青素預處理可通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白表達顯著增強線粒體膜電位；此外,花青素預處理通過減弱自由基的產(chǎn)生,顯著減弱了Ap誘導的DNA損傷,表現(xiàn)為Ser15-p53 和 Ser139-H2A磷酸化水平的下降。結論從機制上講,花青素通過影響B(tài)cl-2家族蛋白含量的變化、穩(wěn)定線粒體膜電位,從而有效阻斷了Aβ誘導的PC12細胞凋亡。此外,花青素還通過抑制ROS的生成和大量蓄積而防止PC12細胞因暴露于Aβ而導致的DNA損傷。均提示花青素可以作為一種藥物用于預防和治療氧化應激引起的神經(jīng)毒性損傷,具有作為一種有效治療或延緩臨床常見神經(jīng)退行性疾病進程的巨大潛力。第三部分花青素對光化學法誘導的小鼠局灶性腦缺血模型的保護作用及其機制研究研究背景缺血性卒中通過氧化應激這一機制導致了神經(jīng)損傷。很多研究證實,腦缺血引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷與缺血引起機體應激導致的過氧化損傷后ROS清除障礙、產(chǎn)生和蓄積過多進一步引起DNA損傷、炎癥及線粒體功能障礙從而導致細胞凋亡等機制有關。主要組分為類黃酮的花青素抗氧化能力極強,因此,我們研究花青素對缺血性腦卒中引起的神經(jīng)毒性的保護作用并且探討其可能的機制。研究目的建立光化學法誘導的小鼠局灶性腦缺血模型,探討花青素預處理在此過程中的保護作用及其機制。研究方法Moor多普勒檢測局部腦血流量、進行神經(jīng)行為學評分、評估腦功能損傷情況輕重,測定梗死體積;TUNEL-DAPI共同染凋亡,腦組織氧化應激指標含量如ROS、SOD、MDA的含量熒光探針及比色法采用用多功能酶標儀檢測,Western blot檢測細胞內(nèi)PARP、Caspase-3、HO-1、Nrf-2等蛋白含量。結果花青素預處理可以顯著增加成模小鼠局部腦血流量,改善腦缺血小鼠神經(jīng)功能及行為學評分,梗死體積縮小、。 TUNEL和DAPI染色發(fā)現(xiàn)花青素預處理能減輕腦缺血小鼠腦組織內(nèi)細胞凋亡的特征表達,減輕了Caspase-3激活和PARP分裂；顯著抑制ROS的生成降低了MDA的含量,SOD含量增加,HO-1、Nrf-2蛋白表達水平增高。結論花青素預處理對局灶性腦缺血小鼠腦組織具有明顯的保護作用,其主要機制可能與花青素預處理減少ROS蓄積及脂質過氧化,機體的抗氧化損傷機能加強,DNA損傷減弱,而且顯著抑制了細胞凋亡等機制有關。可見花青素作為一種天然抗氧化劑及凋亡抑制劑,在臨床缺血性腦卒中的預防和治療應用中具有巨大潛力。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R741

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本文編號：2349476