【摘要】：腦動(dòng)靜脈畸形(brain arteriovenous malformations,bAVMs)是一種先天性的局部腦血管發(fā)育異常,是導(dǎo)致青年和兒童自發(fā)性腦出血的重要原因,嚴(yán)重危害人類的健康,然而其發(fā)生發(fā)展的病理生理學(xué)機(jī)制目前尚未明確。近幾年的研究表明,顱內(nèi)靜脈高壓(venous hypertension,VH)通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子-1α/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(HIF-1α/VEGF)信號(hào)通路參與調(diào)控血管生成過(guò)程,是bAVMs發(fā)生發(fā)展的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)。核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)也參與血管生成的調(diào)控,且其調(diào)控作用與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)密切相關(guān)。然而,在bAVMs的形成過(guò)程中,顱內(nèi)VH誘導(dǎo)下的Nrf2與VEGF表達(dá)及交互作用情況目前尚不清楚。因此,本研究主要目的是探究顱內(nèi)VH誘導(dǎo)的Nrf2及VEGF表達(dá)及交互作用情況在bAVMs發(fā)生中的作用。目的:(1)建立大鼠顱內(nèi)VH模型,利用免疫組織化學(xué)染色法(immunohistochemistry,IHC)及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative Real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法探究腦內(nèi)Nrf2-ARE及HIF-1α/VEGF信號(hào)通路的表達(dá)情況,并利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)下調(diào)Nrf2的表達(dá)來(lái)進(jìn)一步明確其在bAVMs發(fā)生中的作用。(2)在體外培養(yǎng)的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvessel endothelial cells,BMECs)中,探求是否存在Nrf2與VEGF之間的交互作用關(guān)系,同時(shí)利用Nrf2基因敲除小鼠的BMECs,探究Nrf2缺失對(duì)于BMECs遷移及脈管形成能力的影響。方法:(1)利用單側(cè)頸總動(dòng)脈與頸外靜脈血管吻合技術(shù),建立大鼠顱內(nèi)VH模型,分別于造模后的第1、3、7天取腦組織,利用IHC方法檢測(cè)大腦皮層及海馬區(qū)Nrf2的表達(dá),利用Western Blot及qRT-PCR檢測(cè)腦組織中Nrf2-ARE及HIF-1 α/VEGF信號(hào)通路激活情況。利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)下調(diào)Nrf2表達(dá),探究其對(duì)顱內(nèi)VH下VEGF表達(dá)的影響。(2)體外分離和培養(yǎng)小鼠原代BMECs,利用VEGF165刺激BMECs,檢測(cè)Nrf2-ARE信號(hào)通路的激活情況,同時(shí)利用MEK1/2抑制劑PD98059預(yù)處理細(xì)胞,探究MEK1/2在其中發(fā)揮的作用;反之,利用Nrf2激動(dòng)劑特丁基對(duì)苯二酚(tert-Butylhy droquinone,t-BHQ)刺激 BMECs,檢測(cè) HIF-1α/VEGF 通路的表達(dá)情況,同時(shí)利用小干擾RNA技術(shù)抑制BMECs內(nèi)HO-1的表達(dá),探究在HO-1缺失的情況下,t-BHQ是否仍能激活HIF-1α/VEGF通路。(3)利用Nrf2野生型及Nrf2敲除型BMECs進(jìn)行Trans-well細(xì)胞遷移試驗(yàn)及脈管形成試驗(yàn),明確Nrf2對(duì)BMECs遷移及脈管形成能力的影響。結(jié)果:(1)IHC結(jié)果顯示,顱內(nèi)VH組大鼠的皮層和海馬區(qū)腦組織內(nèi)Nrf2染色陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量顯著多于正常對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。同樣Western blot與qRT-PCR結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,顱內(nèi)VH顯著激活Nrf2-ARE及HIF-1α/VEGF信號(hào)通路,相關(guān)蛋白及mRNA水平明顯增高,且抑制Nrf2表達(dá)后,該激活效應(yīng)也得到顯著抑制。(2)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,Western Blot與qRT-PCR結(jié)果顯示,VEGF165可以顯著激活BMECs內(nèi)Nrf2-ARE信號(hào)通路,且該激活效應(yīng)可被MEK1/2抑制劑PD98059顯著抑制;反之,Nrf2激動(dòng)劑t-BHQ可以激活BMECs內(nèi)HIF-1α/VEGF信號(hào)通路,且該效應(yīng)可被針對(duì)HO-1的小干擾RNA顯著抑制。(3)Trans-well細(xì)胞遷移及脈管形成試驗(yàn)結(jié)果顯示,VEGF165可以顯著增強(qiáng)BMECs遷移和脈管形成能力,敲除Nrf2后,該促進(jìn)效應(yīng)得到抑制,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。結(jié)論:顱內(nèi)VH誘導(dǎo)和激活的Nrf2-VEGF正反饋環(huán)路可能是通過(guò)調(diào)節(jié)腦血管生成過(guò)程,參與bAVMs的發(fā)生發(fā)展,該機(jī)制有助于部分解釋bAVMs的病理生理學(xué)機(jī)制,為bAVMs提供新的潛在性治療靶點(diǎn)。
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【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R743.4
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本文編號(hào)：2345459